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飞鱼冲冲冲新虫 (初入文坛)
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[求助]
有做链霉菌接合转移的前辈和友友吗，求助！！
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大家好，最近在做链霉菌接合转移条件摸索，由于实验室没人做这个，从开始到现在已经快2个月了，自己独自摸索遇到了一些问题想要请教一下。 ①孢子悬液大家一般用的是第一代（也就是链霉菌在板子上完全变灰产孢后，加入无菌水，用枪头刮取孢子悬浮进行制备），还是用的待第一代制备的孢子悬液再次涂布，待其产孢后再进行制备的第二代或者第三代） ②大家选取质粒和供体菌时一般怎么选取的，有什么依据或者有什么考虑，通过查阅文献我用的是pSET152质粒和PUZ8002大肠杆菌，不知道能不能行得通，也有在文献中看到自己构建载体的。 ③大家进行实验的孢子悬液浓度是怎么设置的，有进行稀释吗，稀释倍数是怎样的。我看文献有的说是用10的-8次方，想知道大家一般怎么来测定孢子悬液的浓度，是通过血球板记数法吗，我前期用这个方法放显微镜下想进行计数来着，发现视野下很难观察，首先是不知道哪个是我的孢子，其次里面还有很多菌丝和长条的东西，观察起来很困难。 ④链霉菌孢子萌发是否为接合转移的前提，还是促进其萌发。因为后期准备筛一下链霉菌孢子预萌发条件，查文献发现有的筛了孢子预萌发条件，有的没有，也有文章没有用链霉菌孢子做接合转移，而是用的菌体，这是否说明孢子萌发并不是链霉菌接合转移成功的前提，只是一个会促进其接合转移的因素。 ⑤筛选孢子预萌发条件，包括它的预萌发液体培养基、时间，根据文献发现详细写这一步过程的，提到是将孢子悬液热激后打入适量到不同的液体培养基中再摇床培养，每隔30分钟放在显微镜进行观察，观察比较它们的萌发情况。谁萌发的快，谁就更好。 可是我将我的孢子悬液案照这个步骤进行的时候发现，通过观察孢子悬液，我发现显微镜视野下很多长条，菌丝，不太清楚哪一个才是链霉菌孢子，我有通过将孢子悬液多过滤几次，希望充分将孢子悬液中的菌丝杂质除去，结果发现再次观察的时候还是存在这种情况，后期准备先用一种液体培养基培养孢子悬液，每隔一段时间在显微镜下观察链霉菌萌发情况，了解它的萌发形态。不知道能不能行得通。不知道做过这一步的前辈，大家的链霉菌孢子都是啥样的，都怎么来做的预萌发条件筛选，有没有什么建议能否提供。 ⑥还有就是热激温度和热激时间的筛选。查文献发现有的是直接把转进质粒的供体菌和受体菌放在一块儿培养一段时间，观察不同温度时间下的接合子生长情况数量来进行筛选。有的是通过显微镜观察不同热激温度和热激时间下孢子的萌发情况来进行比较。自我感觉两种方法有利有弊，前者等接合子长出来这段时间比较长，但更直观，后者一天之内就能知道，但是显微镜观察存在很多主观性，观察也不太好观察。想知道前辈们是怎么来做这一步的，有没有好的建议。 ⑦最后就是对这方面比较了解或者做成功的前辈或者友友，有没有protocal，可否方便提供一下，如果可以，不胜感激！！！@天使托 |
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