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分子实验中几种酶的作用原理
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01 限制性内切核酸酶 图片 限制酶主要存在于微生物(细菌、霉菌等)中。 一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。是特异性地切断DNA链中磷酸二酯键的核酸酶(“分子手术刀”)。 发现于原核生物体内，现已分离出100多种，几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组DNA技术和基因诊断中重要的一类工具酶。例如，从大肠杆菌中发现的一种限制酶只能识别GAATTC序列，并在G和A之间将这段序列切开。 目前已经发现了200多种限制酶，它们的切点各不相同。苏云金芽孢杆菌中的抗虫基因，就能被某种限制酶切割下来。 02 DNA连接酶 图片 DNA酶能利用ATP或NAD+水解提供的能量催化DNA链的5'-磷酸末端与另一DNA链的3'-OH生成3',5'-磷酸二酯键，从而把两个DNA链连接起来。 常见的DNA连接酶有T4 DNA连接酶，Taq DNA连接酶等，这些酶的主要连接DNA片段之间的磷酸二酯键，起连接作用。 03 DNA聚合酶 图片 DNA聚合酶的主要功能是催化脱氧核苷酸之间的聚合反应。主要是连接DNA片段与单个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，在DNA复制中起作用。 DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。 DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链;而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。因此DNA连接酶不需要模板。 04 RNA聚合酶 图片 RNA聚合酶以完整的双链DNA为模板，转录时DNA的双链结构部分解开，转录后DNA仍然保持双链的结构。 真核生物RNA聚合酶：真核生物的转录机制要复杂得多，有三种细胞核内的RNA聚合酶：RNA聚合酶I转录rRNA，RNA聚合酶II转录mRNA，RNA聚合酶III转录tRNA和其它小分子RNA。在RNA复制和转录中起作用。 05 逆转录酶 图片 逆转录酶是属RNA指导的DNA聚合酶，具有三种酶活性，即RNA指导的DNA聚合酶，RNA酶，DNA指导的DNA聚合酶。 在分子生物学技术中，作为重要的工具酶被广泛用于建立基因文库、获得目的基因等工作。 06 解旋酶 图片 解旋酶是一类解开氢键的酶，由水解ATP来供给能量它们常常依赖于单链的存在，并能识别复制叉的单链结构。在细菌中类似的解旋酶很多，都具有ATP酶的活性。大部分的移动方向是5'→3'，但也有3'→5'移动的情况，如n'蛋白在φχ174以正链为模板合成复制形的过程中，就是按3'→5'移动。在DNA复制中起作用。 07 核酸酶 图片 核酸酶就是指能降解核酸的酶，与聚合酶的功能相反，它们水解或打开在多核苷酸链中的相邻核苷酸的磷酸二酯键内的酯键。根据其特性不同，将核酸酶分为内切核酸酶和外切核酸酶，内切核酸酶能水解多核苷酸链中的内部键，而外切核酸酶则必须从末端开始水解反应。 根据其对核酸专一性，分为对DNA产生专一性作用的DNA酶（DNase);或对RNA特异性作用的RNA酶（RNase);甚至对DNA/RNA杂合体特异性作用的RNA酶H（RNase H),它切割杂合双连体的RNA链。 08 蛋白酶K 图片 蛋白酶K是一种从白色念珠菌分离出来的强力蛋白溶解酶，具有很高的比活性，在较广的pH范围（4〜12.5)内及高温 (50〜70°C)下均有活性，EDTA等螯合剂或SDS等去垢剂均不能使之失活。用于质粒或基因组DNA、RNA的分离和抽提。 在病毒核酸检测中，蛋白酶K是病毒采样液中的重要组分之一，蛋白酶K可以裂解病毒的外壳蛋白并使其失活，同时将病毒基因组释放以便后续进行核酸抽提。 09 UNG酶 图片 UNG酶（Uracil-N-Glycosylase）的作用原理是选择性水解断裂含有dUTP的双链或单链DNA中的尿嘧啶糖苷键，形成的有缺失碱基的DNA链，在碱性介质以及高温下会进一步水解断裂，从而被消除；UNG酶的最佳活性温度为50℃，在95℃会被灭活。 由于普通的Taq酶即使在室温下也有一定的活性，如果不采取措施，在加入PCR试剂的过程中、正式PCR开始前就会发生少量扩增，从而增加背景信号，可能影响PCR定量的精度。 因此在PCR试剂盒中可使用dUTP代替dTTP，如果在实验前产生非特异性扩增，产物会含有dUTP，在定量PCR开始前增加50℃的保温步骤，UNG酶即可将已有的PCR产物降解破坏，防止可能造成的污染。 |
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