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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » PCR优化问题汇总【绝对有帮助！转载 】
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經天

铁杆木虫 (著名写手)

[交流] PCR优化问题汇总【绝对有帮助！转载 】

PCR在产物序列中引入了错误？
参考见解：
1 聚合酶忠实性低：使用带有校正活性的热稳定聚合酶，如Platinum Pfx DNA聚合酶。
2 循环数太多：降低循环数。
3 四种dNTP的浓度不同：制备新的dNTP混合物，保证四种核苷浓度相同。使用预混合物。

PCR跑胶，目的条带很亮，但是边沿不清楚，前后有拖尾现象？
参考见解：
1模板可能有降解，建议避免反复冻融，放置时间不能太长。模板的质量是最重要的。
2抽提RNA时有污染，包括基因组DNA污染和蛋白质污染，需重做抽提。
3提高退火温度，减少非特异性扩增。
4减少循环次数，减少非特异性扩增。
5电泳缓冲液时间太长，ph值和盐离子浓度明显改变。
6电泳时电压不能太高，8V/cm。
7一般来讲，基于promega和TaKaRa的PCR反应体系中，Mg和dNTP的浓度是相匹配的，不需改动。
8 加样量过大。过多的量会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的DNA此现象更明显。
9制胶过程中胶孔没制好。
10 EB没有冲洗干净。
11模板混有基因组DNA，或模板中混有蛋白。
12非特异反映。引物设计的不好，非特异，这种情况容易出现非特异扩增造成有非特异性扩增带或拖尾现象。
13电泳液用久了不换，电泳胶脏了 。
14扩增的条件不合适，一般退火温度低时容易使引物在非特异位置结合引发扩增反应造成拖尾。
针对以上情况，可以先提高退火温度试试，如果实在不行，再看看引物是不是合适。。
　　如果内参可以扩出来，只能说明程序可能是适合的，但不能完全说明体系合适。体系内的各组分，如模板、dNTP、Mg离子、引物等都可能造成拖尾。先得考虑换了那种成分后出现了拖尾，逐项试验。引物当然是最重要的因素，但绝非造成拖尾的唯一原因。而且，一般而言，拖尾不会是引物的问题，尤其是已经被用过证明能扩出特异片段的 引物，更不可能是它的问题了。先不要加Taq酶，等到其他东西都加完了以后，放到PCR仪上去，到那时再加，马上开启PCR程序试试。
检查一下你的dNTP的量够不够。适当减少2～3个循环试试，可能会有效果。

PCR结果总是不满意，请问要注意些什么？
参考见解：
1将PCR反应的试管与反应板紧贴。
2当酶反应混合物以70℃“热启动”开始循环时，切记在加入酶后稍微振荡一下，因为在0.2-ml的PCR管中不能均匀传热。
3不要随意减少dNTP的用量，它是一个系统的因素，必须与其它成份保持平衡。
4对于有问题的PCR反应，例如模板的量少，模板不纯和环状模板等，先尝试加Taq酶前的体系进行预变性，后加模板进行正常PCR扩增。
5没有扩增产物： 在提供MgCl2缓冲液中，以0.25mmol/L为梯度增加MgCl2浓度；无MgCl2的缓冲液以0.5 mmol/L为梯度增加MgCl2浓度。
6泳道中出现模糊条带，如果DNA模板中存在RNA，则按上述提示浓度补加MgCl2，因为在PCR反应中可能缺少游离的Mg2+。
7检查退火温度和变性条件，如果有需要的话，可降低退火温度。
8检查模板和引物的用量。
9增加循环次数和/或模板DNA的用量。
10泳道中出现模糊条带： 减少循环次数或模板DNA的用量。 提高退火温度，但不要超过68℃。 重新设计引物或设计更长的引物。
11 建议使用0.2-ml薄壁管。厚壁管在92℃时不能有效地使模板变性。 最佳反应体积为50ml，推荐用30ml矿物油覆盖（对盖子加热的PCR仪可以不加）。 大多数反应中，0.75ml（0.5~1ml）的酶量在大多数情况下可以得到满意的结果。 建议使用1.75mmol/L MgCl2∶350mmol/L dNTP或2.25mmol/L MgCl2∶500mmol/L dNTP组合的混合物。然而要得到最佳结果，优化Mg2+的浓度是必需的。
12基因组DNA模板的质量显著影响PCR反应。因此推荐使用琼脂糖凝胶电泳来检测DNA的长度。DNA片段长度可以超过50kb，传统的基因组DNA能扩增片段至10kb。 要扩增更长的片段应使用超纯或高分子量的DNA。请查阅高分子量DNA提取操作过程相关文献。 降低二级结构和引物二聚物形成的可能性。进行长片段PCR扩增时，引物长度一般为24~34个核苷酸，溶点在60~68℃间。使用这类引物可提高PCR反应的退火温度来增加反应的特异性。这点非常重要，长片段扩增的效果往往受到非特异性短片段优先扩增的影响。
13变性：第一步变性在94℃下进行2分钟。在循环过程中尽可能缩短变性时间（94℃下进行20--30秒），除非模板中富含GC，则95℃下变性30秒。这可以防止DNA脱嘌啉和链断裂，对于所需扩增的基因组DNA片段终长度超过12 kb时，应该尽可能的降低变性温度。
14延伸：68--72℃下进行延伸操作。 循环延伸：尽量采用循环延伸的条件，若PCR仪无此功能，则必须增加延伸的时间，例如在扩增10kb片断时，延伸时间用10分钟替代原来的8分钟。 长片断PCR系统扩增的片断其3’-末端带有一个突出的A，因此建议采用T/A克隆。若要进行平端可隆，可用Klenow酶和T4 DNA多聚酶将PCR产物补平后再进行。 测序时因酶的混合物带有3’→5’外切酶活性，用Sanger方法进行测序不能产生均一的（染色体）带型。
15 引物设计： 一般长度20-30bp； 至少50%的GC含量； 避免引物二聚体和二级结构； 引物对的Tm值应该接近。

假阴性，不出现扩增条带？
参考见解：PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
1 模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。
2 酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
3 引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单 位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有 引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条 带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条 亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融 或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不 够，引物之间形成二聚体等。
4  Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
5 反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多 大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。　　
6 物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出 现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影 响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下 扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。
7 靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
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一种与世无争的上进，内在的坚毅和质朴无华的大度！【穷吾一生而追求之！】
1楼 2009-10-27 16:40:37
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經天

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by luckyyan at 2009-10-27 20:56:
一种与世无争的上进，内在的坚毅和质朴无华的大度！【穷我一生而追求之！】
楼主说出了兄弟内心的想法！！！

这也是我心追求的。。
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一种与世无争的上进，内在的坚毅和质朴无华的大度！【穷吾一生而追求之！】
11楼2009-10-28 08:58:53
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經天

铁杆木虫 (著名写手)
出现非特异性扩增带？ PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带？
参考见解：非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：①必要时重新设计引 物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带？
参考见解：其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓 度。④增加模板量，减少循环次数。

克隆PCR产物的最优条件是什么？
参考见解：最佳插入片段：载体比需实验确定。1：1（插入片段：载体）常为最佳比，摩尔数比1：8或8：1也行。应测定比值范围。连接用5ul 2X连接液, 50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶，插入片段共10ul。室温保温1小时，或4oC过夜。在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。室温保温1小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需4℃过夜。
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一种与世无争的上进，内在的坚毅和质朴无华的大度！【穷吾一生而追求之！】
2楼2009-10-27 16:42:34
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經天

铁杆木虫 (著名写手)
如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？
参考见解：
1 涂布未转化的感受态细胞。如有菌落，表明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄抗型的菌落。
2转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。例如，将1ug/ul质粒1:100稀释,1ul用于100ul感受态细胞转化。用SOC稀释到1000ul后，用100ul铺板。培养过夜，产生1000个菌落。转化率为： 产生菌落的总数/铺板DNA的总量。铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用10ng DNA，用SOC稀释到1000u后含10 ng DNA，用1/10铺板，共用1 ng DNA。转化率为：1000克隆X10（3次方） ng /铺板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug转化pGEM-T应用10（8次方）cfu/ ug感受态细胞如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。
3 如用pGEM-T正对照，或PCR产物，产生>20-40蓝斑（用指定步骤10（8次方）cfu/ ug感受态细胞），表明载体失去T。可能是连接酶污染了核酸酶。T4 DNA连接酶（M1801，M1804，M1794）质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来源的T4 DNA连接酶替换。
4 用pGEM-T或pGEM-T Easy载体，连接pGEM-T正对照，转化高频率感受态细胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的实验步骤，可得100个菌落，其中60%应为白斑，如产生>20-40蓝斑, 没有菌落或少有菌落，连接有问题。

对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？
参考见解：
1 连接用室温保温1小时，能满足大多数克隆，为提高效率，需4oC过夜。
2 插入片段带有污染，使3`-T缺失，或抑制连接，抑制转化。为此，将插入片段和pGEM-T正对照混合，再连接。如降低了对照的菌落数，插入片段需纯化，或重新制备。如产生大量的蓝斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy载体3`-T缺失。
3 插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段，因受UV过度照射，时有发生。UV过度照射会产生嘧啶二聚体，不利于连接，DNA必需重新纯化。
4 带有修复功能的耐热DNA聚合酶的扩增产物末端无A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy载体克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。详情查pGEM-T pGEM-T Easy载体技术资料（TM042）。
5高度重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如发现插入片段高频率地产生缺失和重排，需用重组缺陷大肠杆菌菌株，如SURE细胞

PCR体系是10ul的，每次PCR完了以后，管壁上有一层水气，需不需要覆盖矿务油？加多少，具体步骤应怎样？
参考见解：是否覆盖矿物油，要看你用的是那种PCR仪了，目前新出的PCR仪都用不着加，因为有热盖技术、密封严格，如PE2700，2400，9600，9700等PCR仪，可以看看所用PCR仪的说明书，应该提到的。去除石蜡油比较有效的方法：1。PCR反应之后，把反应管放的-20C，冻上20-30分，石蜡是不会冻住的，等水相结冻之后，拿出管子，迅速把上面的石蜡油吸掉。2。用一张干净的Parafilm，将反应液点到上面，轻轻移动或提起膜，石蜡油比较粘膜而水相会流开，分开后吸取水相。

PCR加样孔上有很亮的条带，但没有产物条带？
参考见解：最大的可能性是蛋白质（taq酶）与产物结合，滞留在加样孔。解决方案，loding buffer加入0.1％sds为了排除其它可能（例如大片段），可以作一个无反应对照，所有条件都一样，就是不上PCR仪器。然后同时跑电泳，看看上样孔内情况。
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一种与世无争的上进，内在的坚毅和质朴无华的大度！【穷吾一生而追求之！】
3楼2009-10-27 16:45:12
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經天

铁杆木虫 (著名写手)
PCR的产量有许多因素决定他们的主次关系是什么,各因素又是怎么调节的？
参考见解：
1、 退火步骤的严格性：提高退火温度可以减少不匹配的杂交，从而提高特异性。
2、 减短退火时间及延伸时间可以减少错误引发及错误延伸。
3、 引物二聚体是最常见的副产品，降低引物及酶的浓度也可以减少错误引发，尤其是引物的二聚化。
4、 改变MgCl2(有时KCl)浓度可以改进特异性，这可能是提高反应严格性或者对Taq酶的直接作用。
5、 模板中如果存在次级结构，例如待扩增的片段易自行形成发夹结构时，可在PCR混合物中的4×dNTPs中加入7-脱氮-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸（7-deaza-2’-deoxyguanosine-5’-trihosphate）(de7GTP)。用de7GTP与dGTP比例为3：1的混合物（150μmol/l de7GTP +50μmol/L dGTP）代替200μmol/l dGTP，则可阻非特异性产物的生成。

PCR产物大约有900bP，哪种测序方法比较好？直接用纯化的PCR产物测序还是克隆到T载体上再测序？纯化PCR产物的方法哪种比较好？
参考见解：
1、 PCR产物直接测序对PCR产物纯度要求较高。体系中不得有杂带，引物二聚体等。另外PCR产物在体系中需达到一定量，一些低丰度的模板，则需通过增加循环数来达到，但循环数太多易出现突变。克隆到T载体上比较好。经典，且利于保存。酶切鉴定后，选取有正确插入片段的克隆，在将此克隆菌种摇过夜，用1.5毫升EP管装菌液，送公司测序。这样的好处是：公司可以自行铺板子保存菌种，如果第一次测序失败，还可以挑菌落继续测。
2、 测序的一个反应大约可以测500bp，在T载体多克隆位点两侧有T7和SP6两种测序引物，如果片段小于500bp，只测一端就够了。如果大于500bp，建议采用双向测序，同时测T7和SP6两个反应，然后将测序结果拼接起来。这项可以让公司完成，也可以自己用软件完成（如DNASTAR）。
3、 关于纯化PCR产物，建议采用经典的切胶方法。这种方法回收率为50％左右。用此法一般都要用酚氯仿抽提，这是从溶液中去除有机胶必需的。这也是造成产物损失的主要步骤。

引物间形成了比较多的二聚体，使产物很少。这种情况该怎么处理?
参考见解:
1、 不能重新设计就试试降低一下引物浓度，调整一下体系如优化镁离子浓度或改变模板量。形成引物二聚物的原因很多，如聚合酶是否活化,还有program，退火温度太高，时间太短，延伸时间太短都可能是原因。
2、 适当提高退火温度并调整体系中的Mg2+浓度，结合热启动，通常可以有效减少引物二聚体的量。当然，同时也可以减少引物的量，也会有一定的帮助。
3、 还可以做套式PCR:即在目的片段两端外面选择序列设计一对引物,这对引物因为没有位置的限制,可以设计的理想一点,扩增出比目的片段稍长的一段后,作为模板用楼主现在的引物来扩增,比直接扩更有效.

为什么会产生弥散（smear）条带？如何解决？
参考见解： 在PCR反应体系中第一链产物的含量过高。
1、 减少引物的用量。
2、 优化PCR反应条件/减少PCR的循环次数。
3、 在用DNase处理被DNA污染的RNA样品时，其产生的寡核苷酸片段会产生非特异性扩增，一般会显示为弥散背景。

出现多种扩增产物条带？怎么解决？
参考见解：
1、 应用降落PCR，最好再结合热启动PCR或加强PCR（booster PCR）。
2、 优化MgCl2、模板DNA、热稳定DNA聚合酶及dNTP的浓度。
3、 用首次扩增的PCR产物进行1：100稀释后作为模板，再加入新的PCR缓冲液与引物在恒定复性温度条件下进行30个循环的第二次PCR扩增；
4、 进行嵌套式PCR扩增；或者从凝胶上切割目的条带作模板重新进行PCR扩增。
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一种与世无争的上进，内在的坚毅和质朴无华的大度！【穷吾一生而追求之！】
4楼2009-10-27 16:48:19
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