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常见的BCA法检测蛋白定量
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在蛋白质比色定量试验中，最常用的方法是二喹啉甲酸（Bicinchoninic acid，BCA）法蛋白定量。那么为什么我们要选择用BCA法？BCA法是Lowry测定法的一种改进方法，与Lowery法相比，BCA蛋白测定方法操作更简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性更好，几乎没有干扰物质的影响，灵敏度高（微量检测可达到0.5μg/ml），应用更加灵活。与Bradford法相比，BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。 BCA法蛋白定量的原理是什么？ 大多数蛋白样品可通过比色测定法定量，在典型的蛋白测定中，化学试剂加入到蛋白样品溶液里产生颜色变化，这一变化可由分光光度计或酶标仪检测，并与已知浓度的蛋白标准曲线作比较。BCA法是在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+，BCA与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562 nM处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。 BCA法蛋白定量是如何操作的？ 1 先将solution A 摇晃混匀，根据样品数量，按50体积solution A加1体积solution B试剂（50:1）配制成BCA工作液，充分混匀。BCA工作液在24小时内稳定。 2 稀释标准品：蛋白质标准品（5mg/ml BSA，-20℃保存）用生理盐水或PBS稀释成2000ug/ml，1000 ug/ml，500 ug/ml，250 ug/ml，125 ug/ml，62.5 ug/ml，31.25 ug/ml，15.625 ug/ml八个浓度的蛋白标准溶液。（大家根据实验室的标准品的浓度合理设计制作标准曲线的浓度） 3 样本的制备：蛋白质样品用细胞总蛋白提取试剂提取总蛋白。 4 取步骤2中的20ul蛋白标准品和待测样品至96孔板中。 5 在各孔中加入200微升BCA工作液，这时使用加样枪轻柔吹打，将其中液体混匀，这时请注意，尽量小一点力气轻柔一点，不要弄出很多气泡，这样会影响读数，然后再37℃室内放置30-60min。将液体冷却至室温，在酶标仪上测定562nm（或540-590nm之间）的波长的吸光值，最后可根据标准曲线计算出蛋白质的浓度，为样品蛋白质定量。 浓度计算步骤 1 输入相对应的标准曲线值和相应的蛋白样品值，一般是8个点。 2 然后将上面数据做图表（XY 散点图），点击图表里面的散点，右键添加趋势曲线。 3 然后弹出设置趋势线格式，点击选勾最底下显示公式（E）以及显示R平方值。则在图表标题中显示出公式和R2值来。一般 R2值越接近1代表你的标准曲线做得越好，根据标准曲线带入的样品OD值测出的蛋白浓度也越准确。R2值越接近1越好，一般要求为0.99几左右。 4 将样品OD值代入标准曲线的公式中，即得到待测样品蛋白的浓度。 |
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