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[交流] 国自然热点 | Cell再发刊！苏州大学揭示乳酸化调控肿瘤真相

乳酸化修饰一直以来都是国自然热点，高分文章频出。此前乳酸化修饰多聚焦于组蛋白研究中，也有部分非组蛋白的研究，例如浙江大学发表于Molecular Cell的文字表明乳酸也可直接修饰METTL3蛋白提升其酶活性。但是这些大多是乳酸化修饰对肿瘤正相关蛋白的研究而对于肿瘤抑制因子的研究较少。

近期，苏州大学周芳芳在Cell发表了题为Alanyl-tRNA synthetase, AARS1, is a lactate sensor and lactyltransferase that lactylates p53 and contributes to tumorigenesis（IF=45.5）的文章发现肿瘤来源的乳酸是p53的天然抑制剂，并筛选出AARS 1作为细胞内L-乳酸传感器和乳酰转移酶，介导整体赖氨酸乳酰化并靶向p53。p53在DNA结合结构域中特定赖氨酸残基处的乳酰化会减弱其DNA结合和液液相分离（LIPS），从而降低p53的肿瘤抑制作用。

1 文章亮点
肿瘤来源的乳酸能够肿瘤抑制因子p53的功能，但不影响其基因和蛋白的表达。

AARS1是细胞内乳酸传感器，介导全局赖氨酸乳酸化。

p53在K120和K139残基上的AARS1乳酸化损害了p53的LLPS和DNA结合。

β-丙氨酸抑制乳酸结合AARS1，整体乳酸化和肿瘤发生。
2 思路解析
本文最大的亮点就在于作者发现了乳酸化修饰能够抑制抑癌蛋白p53与DNA的结合，进而抑制其下游抑癌通路的激活。

首先作者通过分析The Cancer Genome Atlas 数据库中的乳腺癌样本，运用基因集富集分析(GSEA)，发现乳酸代谢活跃的肿瘤中P53信号通路呈现抑制状态。

接着，通过在细胞模型中加入乳酸钠以及敲除乳酸脱氢酶A (LDHA)的方法，进一步证实了乳酸对P53通路的抑制作用，并通过乳酸化特异性抗体检测到P53乳酸化水平升高，但P53的基因表达和蛋白水平未受影响，暗示乳酸化主要影响P53的功能而非其表达。

为了找出调控P53乳酸化的基因，作者采用了CRISPR基因编辑技术进行全基因组筛选，最终鉴定出丙氨酰-tRNA合成酶1 (AARS1)作为乳酸化过程的关键调节酶。

通过敲减和过表达AARS1，作者验证了P53的乳酸化修饰依赖于AARS1。结构生物学分析表明，AARS1能识别乳酸并催化乳酸-AMP复合物的形成，随后将乳酸转移至P53的DNA结合结构域上的特定赖氨酸残基(K120和K139)，这一修饰阻止了P53的液-液相分离(LLPS)、DNA结合以及受调控基因的转录激活，从而抑制P53的作用。

最后，作者对这一机制进行了药物干预试验，旨在寻找能够逆转P53乳酸化或抑制AARS1活性的化合物，以期为乳腺癌和其他与P53失活相关的癌症提供新的治疗策略。
3 实验结果
1.肿瘤源性乳酸是一种天然的p53抑制因子，可促进p53的乳酸化

作者首先利用TCGA数据进行GSEA分析，发现乳腺癌细胞P53通路被抑制（A）；通过乳腺癌小鼠模型检测肿瘤乳酸及P53水平，再敲除LDHA来正反面证明乳酸确实抑制了P53通路。

再使用乳酸化抗体检测P53乳酸化水平上调，但其基因与蛋白表达并未受到影响，于是推测乳酸化抑制了其功能而不调节其表达。由此引出下一个问题，是那个基因在什么位点调节这一现象？
2.全基因组CRISPR筛选鉴定AARS1介导了肿瘤细胞中赖氨酸的乳酸化
作者通过全基因组CRISPR筛选并测序鉴定发现了丙氨酰-tRNA合成酶1（AARS1）。通过蛋白质组学分析观察到整体赖氨酸乳酸化在AARS1基因敲低后受到抑制，而AARS1的过表达显著增强了整体的赖氨酸乳酸化水平。
3.AARS1直接结合乳酸并以ATP依赖的方式促进赖氨酸乳酸化

为进一步探究AARS1如何介导的赖氨酸乳酸化，通过分子对接模型预测结合位点再点突变筛选结合位点。结果发现乳酸或ATP结合缺陷的HsAlaRS突变体未能增加赖氨酸乳酸化水平。随后乳酰转移验证AARS1催化乳酰基团的转移至赖氨酸残基及AARS1的结合位点。

4.通过催化TP依赖的乳酸-AMP的形成，AARS1将乳酸转移到赖氨酸上的共价缀合物

蛋白质组学筛选鉴定了与p53相互作用的蛋白质，分析p53与HsAlaRS和EcAlaRS的结合亲和力。在HsAlaRS过表达并经乳酸钠刺激的细胞中，p53在K120和K139位点被乳酸化。

乳酸在AARS1的催化下被ATP激活，形成乳酸-AMP中间体，伴随PPi的释放。加入p53作为底物会导致乳酸-AMP的消耗和AMP的产生，表明AARS1催化ATP依赖性的乳酸-AMP形成，进而将乳酸共价转移到目标蛋白的赖氨酸上。
5.p53的位点特异性乳酸化减弱了它们的DNA结合和液-液相分离(LLPS)，从而降低了p53在体内和体外的肿瘤抑制作用

作者进一步探究了p53在DNA结合结构域(DBD)中K120和K139位点的乳酰化对p53活性的影响，以及如何通过遗传密码扩增策略产生位点特异性的乳酸化p53蛋白。通过p53的相分离、遗传密码扩增策略、LacK掺入p53证实了这些乳酰化形式的p53与p53 RE-DNA的结合亲和力显著下降，影响了p53的液滴形成和转录激活能力。

体内模型实验也证实乳酸化的P53具有更高的致瘤性。
6.模拟乳酸化的疾病相关K120和K139变体表现出降低的LLPS和抑制肿瘤生长的能力

通过分析TP53基因数据库和COSMIC，确定了几个癌症相关热点突变，其中K120和K139位点的变异最为突出。

突变将带正电荷的赖氨酸替换为不带电荷（如Asn、Thr、Gln）或带负电荷（如Glu）的氨基酸，从而模拟乳酸化效果。结合试验显示K120和K139位点的突变减少了p53与RE-DNA的结合亲和力，其中K至E突变的影响尤为显著。液-液相分离（LLPS）实验说明突变体的LLPS能力受损，这是p53活性的一个重要方面。

在HCT116细胞系中，野生型p53能够抑制细胞增殖和肿瘤生长，而K120 E和K139 E突变体则失去了这种能力。综上结果证实了K120和K139变异体具有LLPS降低和抑制肿瘤生长的能力。
7.在肿瘤生长过程中，AARS1介导的p53乳酸化可以被β-丙氨酸拮抗

在敲除乳腺上皮特异性AARS1的乳腺癌动物模型中，AARS1表达降低延缓了肿瘤发展，减少了原发性肿瘤负荷。其乳酸浓度与肿瘤负荷呈显著正相关。

患者来源的肿瘤组织样本显示，AARS1表达和蛋白质组乳酸化（包括p53的乳酸化）水平在恶性肿瘤中显著上调。这一结果也证实了在TCGA脑肿瘤样本中AARS1表达与p53活性呈显著负相关这一分析结果。由此表明，在人类癌症中，AARS1调控着包括p53乳酸化在内的全局赖氨酸乳酸化。
β-丙氨酸能够抑制细胞增殖、克隆形成和异种移植肿瘤生长，其效果在加入多柔比星（Dox）后显著增强，后者是一种激活p53的遗传毒性药物。经β-丙氨酸处理的小鼠肿瘤中检测发现p53乳酸化水平降低，且β-丙氨酸联合Dox治疗显著延长了小鼠的寿命。这表明β-丙氨酸可能通过防止p53的乳酸化依赖性失活，具有潜在的治疗应用价值。
4 小结
这篇文章做的非常完整，从发现AARS1作用p53蛋白到机制研究，再到针对该机制的药物干预探索，思路清晰，加入新技术应用，完美符合顶刊偏好。想要研究乳酸化修饰如何发表高分文章，这篇具有一定的借鉴意义。

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