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用于伤口愈合的纳米结构生物活性丝素支架
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【摘要】 全层伤口的无疤痕皮肤再生仍是皮肤组织工程中的一个挑战。在这里，通过模仿细胞外基质的化学成分和生物物理纳米结构，设计了一种新型的生物活性支架。通过引入透明质酸(HA)和天然丝素纳米纤维(snf)，通过冻干法制备了具有较高孔隙率(~92.5%)、吸水率(~96%)和溶胀率(~90%)的丝素SF基支架。在体外，将人脐静脉内皮细胞(HUVECs)植入纳米结构的支架中。结果显示，支架具有更好的细胞相容性，支持细胞扩散、增殖和分化。在体内，支架对裸鼠全层皮肤缺损的影响表明，snf掺入支架不仅可以加速伤口愈合(4周内，高达98.2 ±0.5%)同时，纳米纤维作为模板可以调节胶原排列，抑制瘢痕形成。本研究为探索具有生物活性的天然snf支架材料用于新型创面敷料和人工皮肤提供了有益的策略。该文章发表在《Composites Part B: Engineering》上。 【一、样品制备和表征】 作者将HA溶解于SF溶液中，在溶液中加入NHS和EDC加链接，冻干得到SF-HA支架，将SNFs分散于RSF溶液中通过相同操作得到EDC交联天然SNFs-RSF溶液(见图1)。RSF溶液作为粘合剂将天然SNFs粘附在SF-HA支架上。最后，冻干48h获得SF-HA-SNFs支架。 由下图可知，SF、SF-HA和SF-HA-SNFs支架的孔隙率分别约为89.1±3.4%、92.5±3.9%和91.8±3.8%。与纯SF支架相比，HA的掺入不仅可以增强支架的多亲水性官能团(-COOH、-NH2和-OH)的水结合能力，还可以改善支架的力学性能。此外，纳米纤维可以作为增强机械性能的重要组分也是其典型特征。如图所示，SF-HA和SF-HA-SNFs支架的断裂应力和断裂伸长率分别为12±2.4 KPa和34±4.1%，18.1±3.8 KPa和47.2±6.7%。显然，SF-HA-SNFs支架的力学性能提高了约50%。 【二、体外细胞相容性】 采用CCK-8法检测HUVECs的附着和增殖情况。当细胞接种1 d时，含有HA的支架中细胞的OD值高于纯SF支架。细胞的高活力归因于HA掺入，增加了HUVECs的生长和增殖的亲和性。随着培养时间的延长，细胞在这些支架上的增殖能力显著增强(P < 0.05)。7 d后，SF-HA-SNFs支架的OD值远高于不含天然SNFs的支架。无序的纳米纤维网络与ECM结构相似，可以为细胞增殖提供更有利的微环境。 通过SEM和共聚焦显微镜观察，证实了HUVECs在SF-HA-SNFs支架中的增殖和形态。经过1天的培养，纯SF支架上的细胞呈圆形(图3B)，并聚集在一起。而细胞在SF-HA-SNFs支架上的扩散更好，说明纳米纤维为细胞附着提供了更合适的动态表面。培养7 d后，在SF-HA- snf支架上生长的HUVECs不仅表现出较厚的附着体，而且在SF-HA-SNFs支架上形成了细胞片和ECM。 【三、体内降解和生物相容性】 为了评估不同支架对伤口愈合的能力，在每只小鼠体内制造3个直径为6 mm的全皮肤缺损，并植入3种支架。未做任何支架处理的缺损作为阴性对照。图4展示了不同时间点皮肤创面变化的数字照片记录的小鼠模态缺陷。通过摄影评价来检测支架对小鼠伤口愈合的影响(图4B)。与空白对照组相比，SF-HA-SNFs支架在3周后显示出加速的愈合过程，显示出全皮肤修复的良好前景。伤口愈合过程的定量评估表明，这三种支架在第7天显著加速了伤口愈合，并在测试期间持续。2周后，HA掺入支架处理的伤口愈合率达到70%以上，明显高于纯SF支架(~ 30%)。3周后，SF-HA-SNFs组创面愈合率超过80%，高于其他支架(SF支架44.9±5.8%，SF-HA支架73.8±3.2%，对照组29.2±6.9%)。实验时间点(4周)结束时，SF组和对照组均有明显瘢痕形成，纳米结构支架创面闭合率(98.2%±0.5%)高于SF-HA组(90.6±0.7%)。同时，创面图像重建表明， SF-HA-SNFs支架有抑制瘢痕生长的潜力。 【四、组织学分析】 H&E和MT染色试验进一步分析皮肤创面愈合过程。从H&E染色图像(图5)来看，在植入第1周，皮下组织和各种支架之间没有明显的分离。支架内几乎没有血管样结构的形成。在支架与宿主组织的连接处观察到轻度炎症反应.。第2周，在SF-HA-SNFs支架处理的缺陷部位出现了一些血管新生(箭头)，这可能是由于HA有效地促进了内皮细胞的迁移和活性，从而形成了血管化的致密组织。宿主细胞和新生组织几乎填满了支架孔。第3周，SF组和SF-HA组也形成了新的微血管。同时，SF-HA-SNFs组的降解被松散的组织排列所证实，这可能归因于强大的SNFs纳米模板为细胞生长提供了稳定的活性位点。 随着时间的推移，肉芽组织成熟，毛细血管密度下降。在重塑阶段，所有支架几乎完全降解，并被再生组织所取代，其中SF-HA- SNFs支架重建的肉芽组织结构与正常皮肤相似。 下图显示了胶原纤维沉积在创面愈合过程中的作用。第1周，仅SF组有少量胶原沉积。两周后，各组胶原沉积均有所增加，但SF组和SF-HA组胶原沉积倾向于沿表皮分布。支架降解明显(蓝色-实箭头)，胶原沉积致密，说明所有创面均处于增殖期。在创面愈合的重塑期(约第4周)，胶原沉积发生了很大的变化。在SF和SF-HA组中，胶原蛋白仍然粘稠且有取向。相反，SF-HA-SNFs支架组呈连续沉积，与天然组织高度相似。 【结论】 通过仿生ECM的化学和物理结构，成功设计了一种新型的生物活性支架。通过引入HA，支架具有优异的水结合力、高孔隙率和良好的力学性能。此外，利用绿色稳定的天然SNFs构建类ECM结构支架，体外和体内均证实其具有良好的生物相容性。SF-HA-SNFs支架在细胞粘附、增殖和加速伤口愈合方面的具有巨大潜力。更重要的是，将SNFs引入丝素蛋白支架具有抑制瘢痕形成的积极作用。因此，这种利用类ECM SF支架的新方法在皮肤组织工程中具有巨大的生物材料设计和应用前景。 原文链接：https://doi.org/10.1021/acspolymersau.3c00050 |
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