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新虫 (初入文坛)

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[交流] 丝素蛋白水凝胶微载体在生物人工肝系统中的应用已有1人参与

通讯作者简介：赵远锦，东南大学/南京鼓楼医院教授，博导，国家杰出青年基金获得者、国家“万人计划”科技创新领军人才，科技部中青年科技创新领军人才，国家优秀青年基金获得者，英国皇家化学会(RSC) Fellow，科技部重点专项首席科学家。
主要从事微流控与器官芯片、人造器官、药物智能递送、仿生界面及其医学应用等研究。已发表SCI论文360余篇，IF之和大于5000，其中240篇IF大于10，被引用16500余次（H因子为68）；第一作者/通讯作者论文包括9篇Nature/Science子刊、7篇PNAS、5篇IF大于60、以及43篇IF大于20的论文等；研究成果共申请专利200余项，获授权70余项。两次获得部委科学技术进步奖一等奖、以及中国化学会青年化学奖、中国新锐科技人物、中国化学会-杰出青年科学家奖项。受聘为Smart Medicine和Engineered Regeneration主编，中国科协旗舰刊Research、工程院院刊Engineering、中科院Science Bulletin、Bioactive Materials、Advanced Materials Technology、Science China-Materials等权威期刊副主编或编委。

[摘要]：
生物人工肝在治疗急性肝衰竭方面具有重要价值。目前的努力旨在克服微载体发展中的挑战，特别强调整合高密度肝细胞以提高解毒能力。在此，受肝小叶径向滤过模型的启发，本研究提出了具有仿生生态位的离子特异性丝素微载体，用于高密度培养功能性肝细胞。这些仿生微载体是通过毛细管微流控装置在水相中可控地调节离子类型或浓度而产生的。在这些重结晶的微载体上培养人诱导多能干细胞分化为成熟肝细胞，观察到细胞增殖活性显著增强，代谢和分泌功能增强。基于这些特点，微载体一体化生物反应器可以有效降低肝转氨酶水平，显著提高尿素、白蛋白的产生，提高兔急性肝衰竭模型的存活率。因此，仿生微载体及其衍生的生物反应器在急性肝衰竭和其他肝脏疾病的治疗中具有潜在的临床应用价值。

[研究背景及意义]：
肝损伤和最终衰竭可能由多种因素引起，包括病毒感染、酗酒、肥胖和遗传易感性。尽管肝移植仍然是挽救终末期肝病病人生命的治疗方法，但由于器官短缺和长期免疫抑制治疗的必要性，其实用性仍然受到限制。新兴的生物人工肝(BAL)系统可以模拟肝脏功能并在体外维持患者的基本活动，为移植提供了一个有希望的替代方案。然而，在生物人工肝系统中实现高密度肝细胞培养存在挑战，因为简单地在微载体表面培养细胞实际上并不能增加细胞密度。虽然许多商业上可用的生物材料可以为细胞培养提供高表面积的支架，但由于复杂的合成过程，大多数生物材料都具有固有的生物毒性。此外，肝细胞高度极化，需要特定的环境线索在3D小生境中执行糖原储存，细胞色素P450 (CYP)家族蛋白生产等功能。因此，设计促进肝细胞生长的新型生物材料，建立高效的一体化生物人工肝系统势在必行。

[研究内容]：
在这里，受肝脏微观结构单元中观察到的径向过滤模型的启发，本研究提出了一种新型离子特异性丝素蛋白微载体，具有用于急性肝衰竭(ALF)的仿生壁龛，如图1所示。微流控技术可以精确控制流体的不同相，可以将天然丝素蛋白定制成不同的形态颗粒。利用霍夫迈斯特效应，可以方便有效地控制冰的再结晶过程，有利于促进大冰晶的产生，为生命的发展创造空间。因此，通过微流控技术将丝素蛋白与霍夫迈斯特效应相结合，有可能制备出具有高肝细胞密度微载体的体外仿生肝脏模型。
该研究将微载体和半透性微管结合在一起，构建了一个放射状的肝小叶生物反应器(图2)。肝小叶呈近似六边形，直径范围为1至2 mm(图2a)。肝细胞在小叶内沿中央静脉呈放射状排列。经过净化的血液携带这些过滤物质，然后通过中央静脉输送到肝脏内较大的血管中(图2b-d)。通过微流体技术合成了用于复制肝细胞生长环境的丝素微载体(图2e)。在紫外光和钌(Ru)/过硫酸钠(SPS)存在下，酪氨酸残基之间建立了共价二酪氨酸键。丝素蛋白中含有酪氨酸，提供了实现交联丝素微载体的机会，而无需对生物材料进行复杂的化学处理。
控制冰晶的形成对于多孔材料的可控制备至关重要。冰再结晶过程受特定离子的影响，使用“飞溅冷却”方法，制备并评估三种不同离子(F−，Br−，I−

在2%丝素蛋白溶液中调节冰晶形成的能力(图3a,c)。再结晶过程主要遵循奥斯特瓦尔德熟化。冰晶的生长以较小的晶体为代价，增加了平均晶体尺寸，减少了总晶体数(图3b)。通过对冰晶尺寸的可调控制，可作为微载体内创建孔的模板。
考虑到猪肝细胞的免疫原性和癌症细胞在临床应用中的局限性，我们选择人诱导多能干细胞（hiPSCs）作为肝小叶的基本功能单位(图4)。采用优化的诱导方案生成成熟肝细胞(Mhps)(图4a)。最初，hiPSCs被诱导成肝祖细胞，在诱导一周后进一步成熟为成熟的肝细胞。这些诱导细胞能够正常表达细胞色素P450 (CYP)家族蛋白，如CYP1A2和CYP3A4(图4b)。此外，微载体组的表达因子水平高于二维培养(图4f)。80.9%的hiPSCs衍生Mhps表现出白蛋白(ALB)阳性表达(ALB+)和甲胎蛋白(AFP)阴性表达(AFP-)(图4d,e)，它们也表现出肝细胞的分泌功能。这些结果表明成功诱导hiPSCs转变为Mhps。
尽管临床上已经使用了许多类型的生物反应器，但传统的二维细胞培养模型在氧气和营养物质的交换方面受到限制。因此，我们将再结晶微载体与半透性微管结合，以制备高通量生物反应器(图5)。生物人工肝系统由三个回路组成。分离器将血液和血浆分离形成第一个循环。第二个回路在生物反应器和等离子体之间进行物质交换单元。最后一个循环是由培养基和生物反应器建立的营养供应循环(图5a)。用D-半乳糖胺(D-Gal)诱导兔建立急性肝衰竭模型，实验组用BAL系统处理4 h(图5b)。治疗后，急性肝衰竭家兔的存活率从33%显著提高到68%(图5d)，说明肝脏已经恢复了大部分原有的解毒功能，证明生物反应器是有效的。将约3×1010个细胞装入生物反应器中，选择不同组微载体上的氨耗量作为异种生物代谢指标。由于半透性微管数量多，物质交换频繁，生物反应器内氨消除水平和葡萄糖消耗高于二维培养板(图5e,f)。上述结果表明，血浆流经半透管可有效交换肝脏培养单元分泌的营养物质，同时具有一定的肝脏解毒功能。
[结论]：
在这里，我们提出了一种治疗急性肝衰竭的新型生物人工肝系统。仿生壁龛水凝胶的制备受霍夫梅斯特效应控制。利用微流体技术制备了连续、均匀、高孔隙率的微载体。在成功诱导hiPSCs进入成熟肝细胞后，这些细胞能够在微载体上的仿生生态位孔中生长，表现出正常的解毒相关细胞因子的分泌和表达。在动物实验中，微载体与半透微管有效集成，形成中空纤维生物反应器，提高了动物存活率。目前的生物反应器体积还比较大，成本高，使用不便。将高密度细胞整合到生物人工生物反应器中的未来研究方向将继续关注便携性、成本效益、临床环境适用性和更广泛的应用。研究人员将继续改进生物反应器的设计，采用先进的生物材料和细胞工程技术来提高细胞的稳定性和功能。目标是降低使用人工肝系统的障碍，使更多的医疗机构和患者受益于这项技术。

文章信息：X. Lin, J. Li, J. Wang, A. M. Filppula, H. Zhang, Y. Zhao*, Ion-Specific Hydrogel Microcarriers with Biomimetic Niches for Bioartifical Liver System. Adv. Funct. Mater. 2024, 2402999.

文章地址：https://doi.org/10.1002/adfm.202402999

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