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急需帮助——亚硫酸氢钠修饰（已解决）
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请高人指点一下啦！ 我做甲基化修饰，用亚硫酸氢钠修饰了七八次了，可跑完PCR后就是没条带，我用的是别人的引物是正确的，退火温度也是别人摸索好的，不知怎么就不出结果！ 我将基本步骤列下来，大家帮我分析一下 1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul； 2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH； 3： 42℃水浴30min； 水浴期间配制： 4：10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色） 5： 3.6M亚硫酸氢钠（国产的），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml，加520ul至上述水浴后溶液中。（PH值没有完全是5.0，有过4.99、5.01、5.06、5.10可都没有结果，我在PH=4.99时多加了一点就变成了5.01）6：EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。 7：加200 ul 石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。 8：50℃避光水浴16h。 9. 将移液器枪头伸入石蜡油层下，先轻轻加压使其中一小段石蜡油排出，然后吸取混合液至一洁净1.5mlEP管中。 10：以下使用Promega Wizard Cleanup DNA纯化回收系统（Promega，A7280） 1）70℃水浴预热DDW；配制80%异丙醇； 2）加1ml Promega’s Wizard DNA Clean-up resin，轻柔颠倒混匀，使DNA充分与树脂结合（时间是否有限制，最长我摇过十分钟）； 3）将注射器针筒与试剂盒提供的回收小柱紧密连接后，将上述混合物用移液器移至针筒内，用2ml以上的EP管放置小柱下接收废液。加针栓，轻轻加压，将液体挤出，此时可见小柱内有白色的树脂沉积。（此时是否应该明显感觉到有压力的存在？） 4）将注射器与小柱分离后拔出针栓，再将针筒与小柱连接，向针筒内加入2ml 80％的异丙醇，插入针栓，轻轻加压，将异丙醇挤出。此为洗涤步骤。 5）将注射器与小柱分离，将小柱置于洁净1.5ml洁净EP管上，离心12000rpm，2min，以甩去残余异丙醇成分，使树脂干燥。此时，修饰后DNA处于与树脂结合状态。 6）将小柱取下置于另一洁净1.5mlEP管上，移液器加50ul预热好的DDW，室温放置5min。 7）离心12000rpm，20s，此为洗脱步骤，此时EP管内液体即为洗脱的修饰后DNA溶液，终体积为50ul。 11：加5.5ul 新鲜配制的3M NaOH，室温放置15min。 12：加33ul 10M乙酸铵，以中和NaOH，使溶液PH于7.0左右。 13：加4ul 10mg/ml糖原，此作为沉淀指示剂。 14：加270ul 冰无水乙醇，置于-20度，过夜沉淀。（一般在20小时以上） 15：4度，12000rpm离心，30min，倒去上清液，收集沉淀。 16：加500ul 70%乙醇，4度12000rpm，5min。离心后倒掉上清，再加同量乙醇，共2次。 17：倒掉上清，移液器小心将残余液体吸净，沉淀由不透明变为半透明或透明时，加入20ul-30ulDDW，溶解沉淀。 18：-20℃保存DNA溶液。 基本步骤如上；我感觉到的问题如下： 1、是不是PH不需在5啊，我都在5左右，最接近的就是4.99和5.01，可是没有结果 2、与树脂混合时大约需要多长时间，十分钟够吗？ 3、“将注射器针筒与试剂盒提供的回收小柱紧密连接后，将上述混合物用移液器移至针筒内，用2ml以上的EP管放置小柱下接收废液。加针栓，轻轻加压，将液体挤出，此时可见小柱内有白色的树脂沉积。”此步骤和下一步骤中是否能明显感觉到都堵塞的感觉？ 4、修饰完后是否有人测过其OD值，OD260/OD280、OD260/OD230大约需要多少？还有浓度怎样？我测的值都不太好，虽然但看260/280还行有在1.8-1.9之间的但是单看260处的峰值都不是很好！ 谢谢大家！ 补充：我用的基因组DNA的浓度在2000ng/ul左右，260/280都在1.8-2.0之间，260/230在1.8-2.4之间 [ Last edited by 美丽魔鬼 on 2009-11-24 at 12:13 ] |
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