| 查看: 981 | 回复: 0 | |||
[交流]
美国药典中的支原体检测
|
|
支原体是一类没有细胞壁，能够自我复制的，可以通过过滤器并能够通过人工培养增殖的原核微生物，其不能进行革兰氏染色，但染色时会留下菌落的印记。 支原体是寄生虫和共生体，有些可能对多种动植物宿主致病。在人类中，支原体通常是表面寄生虫定植于呼吸道和泌尿道的上皮内壁，感染可能会持续很长时间，而不会引起明显的细胞损伤。培养物中细胞的感染几乎可以影响细胞代谢的每一条途径，包括细胞表型特征的改变和正常生长。 由于支原体本身的特性，使其不易被清除，支原体污染对于生物技术产品的研究和生产是一个严重且普遍的问题。为了确保生物技术产品和用于生产这些产品的相关材料的安全性，支原体检测是必要的质量控制措施。 根据美国药典第63章节，直接培养法是根据支原体在液体培养基生长过程中，以不同的生长方式导致液体培养基的pH发生变化，从而使含有酚红的液体培养基发生颜色变化，并根据液体培养基的传代平板的生长情况判定检测产品是否抑制支原体的生长。 指示细胞培养法是通过能够与支原体核酸结合的荧光染料对指示细胞进行染色，通过指示细胞在荧光显微镜下观察是否有支原体荧光判定检测产品是否抑制支原体的生长。 直接培养法： 实验周期为28天，在第0天，需要进行液体培养基和固体培养基接种，包括阴性对照，供试品检测，阳性对照和干扰实验。以空白培养基作为阴性对照，以口腔支原体和肺炎支原体作为阳性对照，分别将10 mL的阴性对照，供试品，阳性对照和供试品与支原体的混合溶液接种到100 mL的液体培养基中，支原体的接种总量不大于100 CFU，将接种后的液体培养基置于36±1 ℃的培养箱中进行培养，培养时间不超过21天，并在培养期间，2-3天观察一次液体培养基的颜色变化。 将阴性对照，供试品，阳性对照和供试品与支原体的混合溶液接种于支原体琼脂培养基上，支原体的接种总量不大于100 CFU，接种后将支原体琼脂平板置于36±1 ℃，5-10% CO2，＜0.5% O2的环境中进行培养，培养14天后对支原体在显微镜进行计数。 在2-4天，6-8天，13-15天，19-21天对液体培养基进行传代培养，从液体培养基中吸取0.2 mL培养物，接种在支原体琼脂培养基上，至少接种一块，接种后放入36±1℃，5-10%CO2，＜0.5%O2的环境中进行培养，除了19-21天的培养物培养7天外，其余传代批次的培养物需培养14天。对于阳性对照和干扰实验的传代，需要先观察上次传代平板的结果，若上次传代的平板有支原体生长，则无需继续进行传代，并结束实验。 指示细胞培养法： 实验周期为7天，指示细胞密度需在2E4 cells/mL-2E5 cells/mL范围内。 在第0天，进行阴性对照，供试品检测，阳性对照和干扰实验的接种，以空白培养基作为阴性对照，以口腔支原体和猪鼻支原体作为阳性对照。将1 mL的阴性对照，供试品，阳性对照和供试品与支原体的混合溶液接种至指示细胞，接种后置于36±1℃进行培养。 在第3天，进行指示细胞的传代培养，将阴性对照，供试品检测，阳性对照和干扰实验的指示细胞接种至六孔板中；传代后继续培养3-5天，使用二苯甲酰胺荧光染料对指示细胞进行染色。染色后在荧光显微镜下对指示细胞进行观察。根据观察结果判定供试品是否对支原体的生长存在抑制作用。 参考文献 <1>.United States Pharmacopoeia 63 |
回复此楼» 猜你喜欢
售SCI一区T0P文章，我:8.O.5.5.1.O.5.4,科目齐全,可+急
已经有5人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8.O.5.5.1.O.5.4,科目齐全,可+急
已经有4人回复
-
河北省自然科学基金
已经有9人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8.O.5.5.1.O.5.4,科目齐全,可+急
已经有8人回复
-
西安交大新媒学院副院长用撤稿论文结题
已经有5人回复
-
论文撤稿了
已经有5人回复
-
某211大学教师把个人教师官方主页改成:我跑了我跑了我跑了!官宣跑路！
已经有5人回复
-
26/27申博自荐
已经有9人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8.O.5.5.1.O.5.4,科目齐全,可+急
已经有3人回复
-
揭秘青基评审内幕：几个A才能顺利中标
已经有4人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
10