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质粒载体
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载体 在Cohen和Boyer的实验中，两种质粒都能在E. coli中复制。因此，这两种质粒都可以作为载体，使重组DNA得以复制。所有基因克隆实验都需要这样的载体，我们称之为载体（Vector），但典型的基因克隆实验只涉及一个载体，以及一个依赖于载体进行复制的外源DNA片段。外源DNA没有复制起点，即DNA复制开始的地方，因此除非将其放入具有复制起点的载体中，否则它无法复制。自20世纪70年代中期以来，已经开发了许多载体；这些载体分为两大类：质粒（plasmid）和噬菌体（phage）。无论载体的性质如何，都必须通过转化将重组DNA引入细菌细胞。传统的做法是将细胞在浓缩的钙盐溶液中孵育，使细胞膜变得通透，然后将这些通透的细胞与DNA混合，以使DNA进入细胞。或者，人们可以使用高电压将DNA压入细胞，这个过程称为电转化（electroperation）。 质粒载体 在克隆时代的早期，Boyer和他的同事们开发了一系列非常受欢迎的载体，称为pBR质粒系列。如今，除了pBR质粒之外，人们还可以选择许多其他的质粒克隆载体。一个有用，但稍显过时的质粒系列是pUC系列。这些质粒基于pBR322开发的，其大约40%的DNA已被删除。此外，pUC载体具有许多限制酶切割位点，这些位点集中在一个称为多克隆位点（MCS）的小区域内。pUC载体含有一个氨苄青霉素抗性基因，以允许选择接收质粒拷贝的细菌。此外，它们具有在筛选含有重组DNA的克隆时提供便利的遗传元件。 pUC载体的多克隆位点位于编码β-半乳糖苷酶氨基末端部分（α-肽）的DNA序列（称为lacZ'）内。与pUC载体一起使用的宿主细菌携带编码β-半乳糖苷酶羧基末端部分（β-肽）的基因片段。仅凭这些部分基因产生的β-半乳糖苷酶片段没有活性。但它们可以在体内通过所谓的α-互补来互补。换句话说，这两个部分基因产物可以结合形成具有活性的β-半乳糖苷酶。因此，当pUC18自身转化携带部分β-半乳糖苷酶基因的细菌细胞时，会产生活性β-半乳糖苷酶。如果将这些克隆接种在含有β-半乳糖苷酶指示剂的培养基上，含有pUC质粒的菌落将变色。例如，指示剂X-gal是一种合成、无色的半乳糖苷；当β-半乳糖苷酶分解X-gal时，它会释放出半乳糖和一种可以将细菌菌落染成蓝色的靛蓝染料。 另一方面，通过将一个插入片段放入多克隆位点，通常会中断质粒的部分β-半乳糖苷酶基因。它无法再产生与宿主细胞的β-半乳糖苷酶片段互补的产物，因此X-gal保持无色。因此，挑选带有插入片段的克隆很简单。它们是白色的；其余的都是蓝色的。注意这是一个一步的过程。同时寻找具有以下两个特征的克隆：（1）在氨苄青霉素上生长；（2）在X-gal存在时呈白色。多克隆位点已经精心构建，以保持β-半乳糖苷酶的可读框。因此，即使基因被18个密码子中断，仍然会产生功能性蛋白。但是，大型插入片段的进一步中断通常会破坏基因的功能。 即使有颜色筛选，pUC克隆也可能产生假阳性，即没有插入片段的白色菌落。如果载体的末端在连接到插入片段之前被核酸酶“啃咬”了一点，然后这些稍微降解的载体在连接步骤中简单地闭合，那么lacZ’基因可能已经改变得足以产生白色菌落。这强调了使用纯DNA和不含核酸酶活性的酶的重要性。 载体自连接的现象在我们使用没有颜色筛选的载体时可能成为一个更大的问题，因为这样更难以区分带有插入片段的菌落和没有插入片段的菌落。即使在使用pUC和相关载体时，我们也希望尽量减少载体自身连接的情况。一个好的方法是使用碱性磷酸酶处理载体，这会去除连接所需的5’-磷酸基团。没有这些磷酸基团，载体就无法自身连接，但仍可以与保留其5’-磷酸基团的插入片段连接。上图说明了这个过程。请注意，由于只有插入片段具有磷酸基团，连接产物中会留下两个缺口（未形成的磷酸二酯键）。这些缺口不是问题；一旦连接的DNA进入细菌细胞，它们将被DNA连接酶在体内封闭。多克隆位点还允许使用两种不同的限制酶（例如EcoRI和BamHI）对其进行切割，然后克隆一个具有一个EcoRI末端和一个BamHI末端的DNA片段。这称为定向克隆，因为插入的DNA只能以一个方向放入载体中。（插入的EcoRI和BamHI末端必须与载体中的对应末端匹配。）知道插入片段的方向具有某些好处，我们将在本章后面探讨这些好处。定向克隆还具有防止载体简单地自身重新连接的优势，因为其两个限制酶切割位点是不兼容的。现在有比这些更方便的载体可用。 总结 第一代质粒克隆载体包括pBR322和pUC质粒。后者具有氨苄青霉素抗性基因和一个中断部分β-半乳糖苷酶基因的多克隆位点。通过筛选对氨苄青霉素有抗性的克隆，这些克隆不产生活性β-半乳糖苷酶，因此不会使指示剂X-gal变蓝。多克隆位点还使得进行定向克隆到两个不同的限制酶切割位点变得方便。 |
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