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【科研干货】DNA甲基化引物设计完全攻略
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o.1 DNA甲基化原理 DNA甲基化（methylation）是一种表观遗传修饰，它是由DNA甲基转移酶（DNA methyl-transferase， DNMT）催化S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine， SAM)作为甲基供体，将DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基，主要形成5－甲基胞嘧啶（5-mC）（常见于基因的5'-CG-3'序列）和少量的N6-甲基嘌呤（N6-mA）及7－甲基鸟嘌呤（7-mG）结构基因含有很多CpG 结构， 2CpG 和2GPC 中两个胞嘧啶的5位碳原子通常被甲基化， 且两个甲基集团在DNA 双链大沟中呈特定三维结构。基因组中60%～90%的CpG都被甲基化，未甲基化的CpG成簇地组成CpG岛，位于结构基因启动子的核心序列和转录起始点。DNA 甲基化可引起基因组中相应区域染色质结构变化，使DNA 失去核酶ö限制性内切酶的切割位点，以及DNA 酶的敏感位点，使染色质高度螺旋化，凝缩成团，失去转录活性。5位C甲基化的胞嘧啶脱氨基生成胸腺嘧啶， 由此可能导致基因置换突变，发生碱基错配：T2G，如果在细胞分裂过程中不被纠正，就会诱发遗传病或癌症，而且，生物体甲基化的方式是稳定的，可遗传的。 在真核生物DNA中，5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化学性修饰碱基。CG二核苷酸是最主要的甲基化位点，它在基因组中呈不均匀分布，存在高甲基化、低甲基化和非甲基化的区域，在哺乳动物中mC约占C总量的2－7％。DNA甲基化是表观遗传修饰的主要方式，能在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。为外遗传编码（epigenetic code）的一部分，是一种外遗传机制。DNA甲基化过程会使甲基添加到DNA分子上，例如在胞嘧啶环的5'碳上：这种5'方向的DNA甲基化方式可见於所有脊椎动物。在人类细胞内，大约有1%的DNA碱基受到了甲基化。在成熟体细胞组织中，DNA甲基化一般发生于CpG双核苷酸（CpG dinucleotide）部位；而非CpG甲基化则于胚胎干细胞中较为常见。植物体内胞嘧啶的甲基化则可分为对称的CpG（或CpNpG），或是不对称的CpNpNp形式（C与G是碱基；p是磷酸根；N指的是任意的核苷酸）。特定胞嘧碇受甲基化的情形，可利用亚硫酸盐定序（bisulfite sequencing）方式测定。DNA甲基化可能使基因沉默化，进而使其失去功能。此外，也有一些生物体内不存在DNA甲基化作用。 No.2 DNA甲基化引物设计原则 标准的PCR引物设计原则同样适用于硫化测序PCR(bisulfite sequencing PCR,BSP),除了标准PCR的一些参数外,“MethPrimer”应用3′端算法计算自身退火温度、末端退火温度、碱基对互补率、GC含量、解链温度(Tm),而且还提供了上游引物和下游引物的Tm区别,以及引物中最大允许的单核苷酸重复率。因为所有非甲基化的“C”都被转换成“T”,所以“MethPrimer”中默认的重复“T”为8个,而其他碱基重复数为5个。 DNA的完全硫化是很重要的,因此应选择含尽可能多的非甲基化CpG的“C”区域作为源序列,设计引物。对于BSP,引物设计的原则[1]:①为了区别甲基化DNA和非甲基化DNA,引物不应含有CpG位点;②引物扩增的产物应包含尽可能多的CpG位点。 对于MSP需要设计2对引物,一对是针对于经亚硫酸氢盐处理的甲基化的DNA;另一对是针对于经亚硫酸氢盐处理的非甲基化的DNA。根据甲基化的DNA为模板的PCR扩增甲基化的DNA;根据非甲基化的DNA为模板的PCR扩增非甲基化的DNA。MSP引物设计的原则:①为了最大限度的区分甲基化与非甲基化,引物的3′端至少包含1个CpG位点,我们可以自己设定CpG的“C”距3′末端的最远距离。“MethPrimer”中默认值为3,即是在引物的最后3个碱基中,至少有1个是CpG的“C”。②引物序列中应包含尽可能多的CpG位点。③甲基化引物和非甲基化引物序列3′端应处于相同的CpG位点。如果,2对引物不在相同的CpG位点退火, PCR结果就不能准确反映样本DNA甲基化的情况。但是甲基化引物和非甲基化引物可跨越不同的长度,在起始位点和长度上也可以不同。一般非甲基化引物比甲基化引物长,因为受Tm值限制,由于非甲基化引物中的“C”转化成“T”,导致GC含量降低,从而引起Tm降低。④2套引物应有相近的Tm值,“MethPrimer”中默认2套引物Tm值相差不超过5℃,这种限制可使2个PCR反应在同一PCR仪中进行。 No.3 DNA甲基化引物设计方法 01 获取启动子序列 （1）UCSC UCSC主页（http://genome.ucsc.edu/） 图片 点击菜单栏中Tools →Gene Sorter 图片 Genome 中选择物种选中Human，search框中键入基因名: NKX2-5。 出现以下页面，选择第一个，进入！ 图片 图片 选择第一个，点击sequence 图片 可以通过以上四个选项获得该基因的蛋白，mRNA，promoter以及基因组序列信息，我们这里关注的是promoter，选中包含转录起始位点上游2000bp，下游0~50 bp碱基，点击按钮【get sequence】即获得启动子序列。 图片 （2）Ensemble (http://asia.ensembl.org/index.html) 图片 选择物种为human，键入基因名 NKX2-5。 图片 选取基因 NKX2-5（Human Gene）点击左侧的sequence 图片 后页面显示如下： 图片 序列橙色区域的为外显子，第一个外显子前的序列是启动子，默认为600bp，设置一下。点击左侧configure this page设置需要的启动子长度，一般我们需要2000 bp （同上：选中包含转录起始位点上游2000bp，下游0~50bp碱基），点☑ 图片 获得页面橙色序列前面部分即为启动子序列。 图片 02 软件引物设计 ABI公司：Methyl Primer Express v1.0引物设计 打开软件，在框中输入您所关注的DNA序列 图片 接下来，我们要进行CpG岛评估： 图片 点击 “Find CpG Islands”，将弹出下面提示框： 图片 点击“是”，则可以根据您的需要修改CpG岛参数，点击“否”，则按默认参数进行CpG岛评估，结果见下图： 图片 如图所示：该序列含一个CpG岛，位置为序列661bp-1190bp。点击“Next”，将会把CpG Island 1作为默认序列进行引物设计，当然您也可以随意选取您感兴趣的区域进行引物设计： 图片 继续点击“Next”，选择”DesignBSP Primers” 图片 继续点击“Next”，则会弹出引物设计参数选择的提示框，点击“是”，则可以根据您的需要修改引物参数，点击“否”，则按默认参数进行引物设计： 图片 图片 点击”OK”,软件会根据您设置的参数进行引物设计,结果如下图： 图片 图中不同颜色箭头分别代表上下游引物位置，点击您感兴趣位置的箭头，则该箭头会变成白色，点击右下角红色框中按钮“>BSP Primer Report”,则会导出word版引物完整信息 图片 点击图示方框中位置进行保存即可。 文件中会包含原始DNA序列，亚硫酸盐转化后序列和10对PCR引物信息，第一对引物信息即是您选中的白色箭头引物，包含引物序列，退火温度，PCR产物长度等。 03 在线设计 打开MSP在线引物设计工具页面：http://www.urogene.org/methprimer/ 或者他们新开发的2.0页面http://www.urogene.org/methprimer2/ 进入后我们选择第一个就好 图片 图片 进入引物设计页面后，我们把上一步得到的启动子区序列复制进这个大框框里，然后勾选箭头标示的两个选框，没有其他特殊要求其他部分均按默认选项设置就好。然后点击submit。 图片 新生成的页面中会有CpG岛的预测，后续如果还有其他引物要设计，可能需要这些信息。 将页面继续下拉即出现设计好的引物啦 图片 我们通常没有特殊要求选择第一对引物就可以。要注意MSP需要两对引物，分别针对被甲基化的基因序列和没有被甲基化的。将序列复制下来加入实验设计，done. 当然如果第一对引物不work，建议一次把多组引物都保存下来，以备不时之需。 |
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