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科研顾问_Gu新虫 (小有名气)
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干货分享 | RACE，跑步？no，是cDNA末端快速扩增技术！
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一、RACE简介 本指南描述了新药申请或生物制剂许可申请药效综合汇总的建议内容。虽然生物制剂许可申请提交中没有要求药效综合汇总，申请者最好能提供药效综合汇总，因为它可以表现一致性评价和药物的优点。 本指南中的建议反映了FDA 目前关于信息的想法，一份药效综合汇总应当包含行业信息以提供完整的分析，该分析提供临床试验上可观察到之外的见解。本指南不适用于《公共卫生服务法》监管下的生物制品医疗器械。 药效数据综合汇总代替了第二章G部分，行业指南"临床和统计部分申请的格式和内容指南"。它还包含了2.7.3部分的概念框架和临床疗效的总结， ICH行业指南CTD格式M4E一一疗效。 二、经典RACE 1、3´-RACE 3´-RACE是利用真核生物mRNA的3´端具有polyA结构的特点，使用5´端带有接头序列的oligodT与之结合进行逆转录，获得cDNA。 再利用根据已知序列设计的上游引物和与接头序列互补配对的下游引物进行PCR扩增，得到cDNA的3´末端扩增产物。 引物一：oligo(dT)17和一个35bp的接头(dT17-adaptor)，；引物二：一个基因特异性引物，扩增的特异性取决与其cDNA分子互补。引物三：接头引物，用接头引物来取代dT(17)-adaptor则可阻止长(dT)碱基引起的错配。 2、5´-RACE 5´-RACE是利用根据已知序列设计的下游引物GSP作为逆转录引物，合成一链cDNA；再用末端脱氧核苷酸转移酶和dATP在新合成的cDNA的3'末端加上polyA。 接着用带有接头序列的OligodT引物与一链cDNA的3'末端的polyA结合，合成二链cDNA；再以第二链cDNA为模板，利用GSP和接头引物作为上下游引物进行PCR扩增，得到cDNA的5'末端扩增产物。 三、Adapter-Ligated RACE 在获得mRNA的过程中或多或少会产生很多断裂的mRNA短片段，Adapter-Ligated RACE技术是为了获得更长的mRNA序列，但相对来说不一定能获得全长mRNA序列。 Adapter-Ligated RACE是利用T4连接酶将接头连接到cDNA的两个末端上；在PCR循环的退火步骤中，由于短cDNA的退火温度低，两端接头容易发生退火，形成锅柄状结构，阻止引物与模板的结合，终止PCR反应。长的cDNA退火温度高，不易形成锅柄装结构，因此引物可以与接头结合，可进行PCR扩增。 四、RLM-RACE RLM-RACE技术同样是为了解决mRNA断裂的副反应，利用断裂的mRNA的5´端没有帽子结构的特点，首先在RNA体系中加入牛小肠碱性磷酸酶(CAP)，特异性地识别并切除断裂的mRNA 5'端暴露的磷酸基团；再向体系中加入烟草酸性焦磷酸酶(TAP)，切除mRNA 5'端完整的帽子结构，使mRNA 5'端暴露出一个磷酸基团。 接着加入RNA连接酶将接头与mRNA 5'端暴露的磷酸基团连接，而切除了磷酸基团的断裂RNA则不能与接头结合，这样便获得了5'端带有接头的完整mRNA；最后再进行RT-PCR。 1、mRNA“帽子”结构 帽子结构的化学本质是mRNA转录过程中发生修饰所形成的位于mRNA 5'端的一个特殊结构，即m7GPPPN结构，又称甲基鸟苷帽子。 它是在RNA三磷酸酶，鸟苷酰转移酶，mRNA(鸟嘌呤-N7)甲基转移酶和mRNA(核苷-2´  甲基转移酶共同催化作用下形成的。甲基化程度的不同可形成3种帽子：Cap0型、Cap1型和Cap2型。2、烟草酸性焦磷酸酶 烟草酸性焦磷酸酶可用于水解像mRNA 5´-Cap这样特殊结构的磷酸二酯键，释放出的mRNA的5´端只带有一个磷酸基团。 烟草酸性焦磷酸酶是第一个被纯化出来的能够在酸性溶液中保持活性的磷酸酶。(碱性磷酸二酯酶常为从胡萝卜、甜菜和蛇毒中获得，在碱性条件和金属离子存在的情况下能够保持活性的。) TAP还可用于以下方面： ①放射性标记RNA。RNA被烟草酸性焦磷酸酶去除掉帽子结构，并被Apex磷酸酶去磷酸后，就能够用T4多核苷酸激酶和γ-[³²P]-腺苷三磷酸对其末端进行标记。 ②RNA 5´端转换。即除了能够去除mRNA帽子结构外，烟草酸性焦磷酸酶还能够将RNA的5´端三磷酸酯转换为单磷酸。 3、mRNA脱帽酶(MDE) MDE可以将mRNA 5´´末端的7-甲基鸟苷帽(m7G)结构去除，产生5´单磷酸末端并释放m7GDP。mRNA 脱帽酶能够使各种长度的mRNA脱帽，对Cap0和 Cap1的去除效率相同。mRNA脱帽酶也可将5´三磷酸末端转化为5´单磷酸，但转化效率相对较低。 五、Cap-switching RACE Cap-switching RACE是以Oligo dT作为逆转录引物，逆转录获得一链cDNA；当逆转录到mRNA的5'帽子结构时，莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV)会在新合成的cDNA的3'末端加上若干个胞嘧啶。 接着，使用5'端带有接头、3'端带有polyG结构的接头引物与cDNA 3'端的polyC互补配对，逆转录酶继续以接头为模板合成cDNA，完成接头转化，新合成的一链cDNA 3'端就含有一段接头序列；然后再利用接头引物进行PCR获得RACE产物。 莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶所催化的加尾反应是依赖模板和帽子结构的存在的，只有完整的cDNA末端才会加上胞嘧啶残基。 六、环形-RACE 环形RACE技术(cRACE)，是针对克隆只有部分序列已知的mRNA而设计的。cRACE利用polyT引物进行RTPCR反应扩增第一条cDNA，经过RNseH降解模板后加入T4连接酶。 在加入T4连接酶时发生两种反应：环化反应(连接酶将一条cDNA的头尾相连或是将串联体的头尾相连)和串联反应(两条不同的cDNA头尾相连)。无论是环化反应或是串联反应的产物都可以根据已知序列设计新引物来补充第二条链。 环状分子或串联分子产生第二条cDNA链后，在未知区域的两侧设计一对引物将未知区域置换到已知序列中间，进行普通PCR。环形-RACE使用一对基因特异性引物进行扩增，提高了PCR扩增的特异性。 七、RCA-RACE RCA-RACE是利用ATP依赖性的热稳定连接酶，将一条cDNA末端的5'磷酸基团和3'羟基连接，形成单分子环状DNA。再使用随机引物或基因特异性引物，在具有链置换活性的φ29 DNA聚合酶催化下进行PCR扩增。 RCA-RACE类似于环形RACE，但是RCA-RACE在环化的过程中并不会产生串联结构。 八、T-RACE Targeted(靶向) rapid amplification of cDNA ends (T-RACE)。 |
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