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wjny

新虫 (初入文坛)

[交流] 如何保证接入发酵培养基的接种量一致

新人在进行发酵提产的实验,遇到了一些问题,来问问各位大佬。
1.在从斜面往液体培养基接种时,如何保证不同的菌株的接种量一致呢,因为要比较不同菌株的差异,如果不能保证接种量相同不就没什么可比性吗?个人感觉使用接种环直接挑的误差太大了,但是也想不到什么好方法(菌株本身带有菌丝)。
2.目前标准品溶解在dmso中,可以直接拿这个溶液去跑hplc吗?如果可以要不要做一个纯dmso的对照,如果不可以的话那有什么别的方法吗?
希望各位大佬多多指教
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btphzxc

铜虫 (正式写手)


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1. 直接从斜面挑菌接种似乎不太能够定量。我的建议是从斜面挑菌后接入一个小体积的培养液里,培养一段时间富集菌体,然后测od600或者其他你这个菌种特定的浓度检测波长下的吸光值来定量细胞数。然后按等细胞数计算各种子液的体积,接种进大体积的培养液里发酵培养。

2. 不是很清楚这个意思“可以直接拿这个溶液去跑dmso吗?” 如果是用样品处理细胞后观察细胞生理性质的改变,空白对照(dmso)是需要的;如果是用作层析分离的标准对照,空白dmso没有必要。
2楼2024-05-21 03:59:54
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wjny

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by btphzxc at 2024-05-21 03:59:54
1. 直接从斜面挑菌接种似乎不太能够定量。我的建议是从斜面挑菌后接入一个小体积的培养液里,培养一段时间富集菌体,然后测od600或者其他你这个菌种特定的浓度检测波长下的吸光值来定量细胞数。然后按等细胞数计算各 ...

感谢回答。不过由于我的表述不清可能带来了一些问题。
1.这种菌有较长的菌丝并且会互相聚集在一起,无法直接计数,而且我个人觉得这种聚集状态可能会影响OD的测量。OD和细胞数一般肯定是正相关的,但是具体的比例关系要怎么量化我还是是没什么头绪。不过我也感觉按照液体积接种比较好定量,我的想法是在小的培养液中培养后离心称干重,然后根据干重加入等比例的水,这样保证每个里面菌的密度是一致的,然后再接入种子培养基,不知道这样可不可行。
2.我当时老眼昏花写错了,是跑HPLC,因为标准品溶解在dmso里,我的发酵液则不是,二者都要跑HPLC的,我就在想,dmso会不会对这个结果有影响。
最后,不知道大佬现在是在国内还是国外,要是在国内的话注意身体啊,少熬大夜啊。
3楼2024-05-21 19:59:28
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btphzxc

铜虫 (正式写手)

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小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
wjny: 金币+5 2024-05-22 18:52:41
引用回帖:
3楼: Originally posted by wjny at 2024-05-21 04:59:28
感谢回答。不过由于我的表述不清可能带来了一些问题。
1.这种菌有较长的菌丝并且会互相聚集在一起,无法直接计数,而且我个人觉得这种聚集状态可能会影响OD的测量。OD和细胞数一般肯定是正相关的,但是具体的比例 ...

1. 采用称量细胞重量的方式也是一种常见的手段。如果要采用称量法,尽量把细胞富集到一个比较高的浓度,把细胞的重量占比提高以后能够减小因为离心后取不净的上清液带来的质量上的误差。至于称量后加水调节细胞浓度,如果体积不大,是可以的。不过我建议不如加新鲜的种子培养液来调节,这样就不会给体系带来改变。

2. 了解了。如果你是打算直接把离心后回收的发酵液上HPLC的柱子,我建议把你的标准品用新鲜的发酵用培养液进行一个大比例的稀释,得到一个DMSO的体积可以忽略的在新鲜培养液里的标准品溶液。如果标准品浓度不够进行大比例稀释,我个人认为DMSO仅作为样品的溶剂不会对HPLC的结果造成影响。因为上柱后的样品都是使用同样的A,B液进行洗脱。

我在国外呢,有时差,不熬夜
4楼2024-05-22 02:11:49
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wjny

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by btphzxc at 2024-05-22 02:11:49
1. 采用称量细胞重量的方式也是一种常见的手段。如果要采用称量法,尽量把细胞富集到一个比较高的浓度,把细胞的重量占比提高以后能够减小因为离心后取不净的上清液带来的质量上的误差。至于称量后加水调节细胞浓度 ...

感谢回答,确实使用种子培养基调节对体系的影响小。
我的标准品浓度将近10g/L,稀释应该问题不大,之后应该也要用它做标准曲线,刚好我还预留了一瓶没有接种的发酵液。
祝大佬生活顺利。
5楼2024-05-22 19:03:29
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