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干货分享 ｜PCR和凝胶电泳实验结果常见问题及原因分析
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为了排除某些因素对PCR结果的影响，PCR实验需要对照实验。PCR的阳性对照是Marker，推测PCR产物长度，判断PCR产物是否是目的片段。PCR的阴性对照是PCR的空白管，除了模板不加之外，其成分与其他管一样，证明没有其他模板污染。 由于目前所用的PCR仪器自动化程度较低，操作步骤较为繁杂，人为因素大，这就不可避免地会出现不同程度的误差。轻微的污染、加量的误差等均可导致结果较大的差异，甚至阳性和阴性出现两种迥然不同的结果。在分析测定工作中系统误差产生的原因主要有：方法误差、仪器误差、人员误差、环境误差、试剂误差等。本期我给大家搜集了一些平时经常性遇到的一些问题，希望对大家有所帮助。 要分析遇到的问题，除了考虑必要的仪器外，需要明确PCR（聚合酶链反应）的基本要素： 引物：这些是特别设计的短DNA序列，作为DNA合成的起始点，针对目标DNA的两端进行互补配对。引物长度一般在20到30个核苷酸之间。 DNA聚合酶：以Taq聚合酶为代表的酶类，负责新DNA链的合成。Taq聚合酶能够在引物附着的地方开始工作，通过逐一添加核苷酸来延长DNA链。这种聚合酶能够耐受PCR过程中必需的高温条件，这是因为它来源于能在热水环境中生存的微生物。 脱氧核苷酸三磷酸（dNTPs）：这些分子提供了新DNA链合成的原料，包括四种类型：dATP、dCTP、dGTP和dTTP。在PCR过程中，Taq聚合酶利用这些dNTPs来逐步构建新的DNA链。 目标DNA提取：实验开始之前，首先需要从样本中提取出所要研究的DNA片段。 缓冲溶液：提供适宜的反应环境，确保PCR反应能够有效进行。 氯化镁（MgCl2）：作为Taq聚合酶活性的辅助因子，对于酶的功能至关重要。 1.耗材选择不当对实验结果造成很大的影响 PCR耗材一般都是聚丙烯（PP）材质，因其为生物学惰性材料，表面不易于粘附生物分子，且有着良好的化学耐性，及温度耐受性（可121℃高压灭菌，也可以承受热循环过程中的温度变化）。这些材料通常会与试剂或者样品直接接触，因而在生产制备过程中需要选用高质量的材料和良好的加工工艺。 PCR管的体积大多数都可以满足PCR反应要求。但是在满足实验要求的基础上，优先推荐选用低容管。因为低容反应管有着较小的上方空间，可提高热传导率并降低蒸发。而且在加样时，需要避免加样过量或过少。过量会导致热传导率下降，溢出及交叉污染，而加样过少可能会造成样品蒸发损失。 2.假阴性（无扩增产物）——现象：阳性对照有条带，而样品则无 原因：模板含有抑制物，含量低；缓冲液（Buffer）对样品不合适；引物设计不当或者发生降解；反应条件：退火温度太高，延伸时间太短。 对策：纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量；更换Buffer或调整浓度；重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物；降低退火温度、延长延伸时间。 3.非特异性扩增 ——条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带 原因：引物的特异性不强、提取模板DNA中可能会有非靶基因性同源序列；模板或引物浓度过高；酶量过多；Mg2+浓度偏高；退火温度偏低；循环次数过多。 对策：重新设计引物；适当降低模板或引物浓度；适当减少酶量；降低镁离子浓度；适当提高退火温度则减少与同源性非靶DNA的互补程度；减少循环次数。 4.拖尾——产物在凝胶上呈模糊不清状态（弥散） 原因：模板不纯；引物浓度不够优化；Buffer不合适；退火温度偏低；.酶量过多；dNTP、Mg2+浓度偏高；循环次数过多。 对策：纯化模板；对引物进行梯度稀释；更换Buffer；适当提高退火温度；适量用酶；适当降低dNTP和镁离子的浓度；减少循环次数。 5.假阳性——空白对照出现目的扩增产物 原因：出现假阳性最大的可能性是污染有非样品性靶基因，特别是进行大量检测或经常性针对同一种靶基因的扩增试验时，如稍不慎重，就会导致样品间的交叉污染及实验室的“随带性”污染。出现假阳性结果的另一种可能是样品中存在有靶基因的同源序列，这在基因组DNA中扩增特异片段时应特别注意，对于样品间的交叉污染，实验室的随带污染、避免假阳性关键在于提高警惕慎重操作。 对策：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用；各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存 。 |
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