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求助：为什么在测POD时要用三氯乙酸终止反应
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| 在POD酶活性的测定中，在比色前都用到了三氯乙酸的终止反应，我对三氯乙酸(TCA)的终止反应的作用不能理解，如果其终止反应是指终止酶促反应，那么为什么接下来的比色值会有变化，有变化是不是说明酶促反应还在继续，那么TCA的终止反应有该如何理解？？？ |
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2楼2009-10-23 14:07:22
HarveyWang
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氧化物酶广泛存在于植物的各个组织器官中。在有过氧化氢存在的条件下，过氧化物酶可以使愈创木酚氧化，产生茶褐色物质，在470nm处有最大吸收峰，可根据单位时间内A470的变化值，计算POD活性大小。 (1)愈创木酚母液（100mM PBS 50ml中），4℃储存。 （2）H2O2溶液（以30%的H2O2溶液用蒸馏水配置，现配现用） （3）POD粗酶液（一定要高速离心，去掉混浊物，否则对测定干扰太大！） （4）1000 mM PBS 100ml （5）蒸馏水 上述试剂反应时按一定比例混合后保温，最后加入H2O2溶液启动反应。 (1)首先说明，POD测定最好用动力学方法，连续监测5min内的A值变化。 用终点法很不准，因为你不知道你加入100ul POD粗酶液的反应速率是不是50ul POD粗酶液的2倍！ （2）TCA沉淀蛋白一般在2-5min才能沉淀完全，这期间你不能保证POD酶活立即消失！ 例如你的测定时间是5或10min，这样，沉淀期间的残余酶活你没法消除，误差太大。 除非你的测定时间在30min以上，这样即使最后有2min的反应，其误差也能减小。 （3）动力学方法的对照是不加POD粗酶液（以蒸馏水代替），但是要加入H2O2溶液启动反应。但其低背景反应也会存在，这跟你所用的缓冲盐和水质有关，尤其是你用的水含有微量的重金属离子，反应照样可以进行！ [ Last edited by HarveyWang on 2009-10-23 at 14:33 ] |
3楼2009-10-23 14:31:47
