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科研顾问_Gu新虫 (小有名气)
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干货分享 | 关于质粒提取的那些事儿
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虽然质粒提取是非常简单的操作，但是很多人对于其中的原理并非清楚。只知道在使用试剂盒的时候，加入溶液1，2，3，不知道溶液中含有的具体成分，也不清楚，每一种成分所起到的作用。 细胞中存在蛋白质，chromsomal DNA，plasmid DNA，RNA，我们的目的是把质粒DNA给提取出来，而且不能掺杂其他的生物大分子。蛋白质可以让它沉淀，RNA可以加入RNase降解，可以看出，质粒提取最关键的问题是如何把chromosomal DNA和plasmid DNA给区分开来。 细菌没有细胞核，只有一个拟核（nucleoid），chromosomal DNA是环状的，但是并非裸露的，上面结合有多种NAPs(nucleoid-associated proteins)。NAPs和基因转录活性可以改变拟核的形态结构。相对之下，plasmid DNA就要简单很多，游离于细胞质中，以共价闭环cccDNA（convalently closed circular DNA ）的形态存在。 质粒提取主要包括三个步骤：菌体扩繁、菌体裂解释放质粒DNA，和质粒DNA的分离与纯化。质粒提取主要有碱裂解法，煮沸裂解法，小量一步提取法等。 质粒提取方法中，最常用的是碱裂解法，它具有得率高，适用面广，快速，纯度高等特色。碱裂解法是根据共价闭合环状DNA与线性DNA的拓扑学结构差异来分离的。其原理是：在强碱环境（pH12.0-12.6）下，细菌的细胞壁和细胞膜被SDS破坏，基因组DNA和质粒DNA被释放出来，宿主细胞的蛋白质、染色体及线性DNA双螺旋结构被破坏而发生变性（质粒DNA因为其分子量小而缠结严密不易变性）。虽然在强碱的条件下共价闭合环状质粒DNA也会发生变性，但两条互补链仍会互相盘绕，并紧密的结合在一起。当加入pH4.8的乙醋酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快（可恢复天然构象），而线性的染色体DNA复性缓慢，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐包盖。当用钾离子取代钠离子时，复合物会从溶液中有效地沉淀下来，离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA（在高盐条件下，细胞碎片、变性的蛋白质和染色体DNA发生沉积，离心后可去除。上清中的质粒DNA可经过乙醇沉积或许硅胶膜特异性吸附等方法，将质粒DNA从上清中回收）。 总结来说，碱裂解法主要使用三种溶液（根据1979年J.Doly发表文章A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA,也就是经常说的碱裂解法)。The principle of alkaline extraction就是选择性地让chromosomal DNA发生变性，而plasmid DNA不会发生变性，仍然以双链形式存在。 在溶液Ⅰ中：Lysozyme可以溶解细胞壁，对于一些细胞壁比较厚的细菌，加入Lysozyme，是不错的选择，但是我们日常提取质粒的试剂盒似乎在溶液Ⅰ中没有添加Lysozyme。EDTA或者CDTA是金属离子螯合剂，能够螯合Ca2+、Mg2+等二价金属离子。大肠杆菌是革兰氏阴性菌，细胞壁最外层是脂多糖LPS，携带负电荷。要维系LPS的稳定性，必须要有足够多的Ca2+。如果用EDTA螯合掉Ca2+，就会使LPS解体，暴露出内层的肽聚糖，因而容易被Lysozyme水解。Ca2+、Mg2+也是细胞膜的重要成分，同时，对于细胞内很多酶的活性至关重要。EDTA可以破坏细胞膜，抑制细胞内许多酶的活性，比如核酸酶，防止DNA被降解掉。Glucose可以给细胞一个osmotic shock(渗透压)，导致细胞壁和细胞膜裂解，还有一种说法，Glucose可以增加溶液的黏稠度。使细胞不至于快速沉降。J.Doly文章只提到一句，用Glucose可以更精确控制溶液PH，不太明白其中的原理。 在溶液Ⅱ中：SDS能够破坏细胞壁，让细胞内容物(Lysate)释放出来，还可以使蛋白变性，性，结合到蛋白质表面。在这个过程中，chromosomal DNA会被降解成线性片段，一旦遇到强碱（12.0-12.5），chromosomal DNA会发生变性分离变成单链，但是plasmid DNA对此PH范围耐受，仍然以双链形式存在。 在溶液Ⅲ中：加入醋酸钠可以中和强碱，chromosomal DNA发生复性，但是无法恢复原来天然的双链结构，而是形成一团缠绕在一起无法溶解的网状结构。高浓度的钠盐溶液可以让SDS-protein-chromosomal DNA复合物沉淀析出。接来下通过高速离心，SDS-protein-chromosomal DNA复合物，其他的细胞裂解物全部沉淀管底，只有plasmid DNA溶解在上清中。 大，小和中提的区别和应用 质粒抽提按得到质粒DNA的量可分为小提，中提，大提。 质粒小提用的菌液量很少，一般1-5ml，提出的质粒DNA量较少，其特点是简便、快速，能同时处理大量试样，所得DNA有一定纯度，此质粒DNA可直接用于DNA序列分析，各种酶促反应，PCR以及部分细胞系的转染等对质粒浓度要求不高的实验。维真生物采用高通量小提试剂盒，从1ml菌液中提取质粒，用90ul洗脱液洗脱得到的质粒浓度为100-200ng/ul，可以满足大部分实验要求，也可以直接用于一般的腺病毒包装，不过维真生物慢病毒、腺相关病毒（AAV）包装一般使用大提试剂盒进行抽提，以保证高滴度及稳定的质量。 质粒中提得到的质粒DNA的量介于小提跟大提之间，一般用30-50ml菌液提取，提取的质粒可用于包括酶切、PCR、测序、连接、转化、文库筛选、体外翻译、转染一些常规的传代细胞等。从50ml菌液中提取质粒可到到500ul质粒浓度为0.7-1ug/ul的质粒。 质粒大提是质粒大量提取的简称，有些实验室称之为大抽。质粒大提用于大量菌液的提取，100ml-500ml 均可，大规模地从细菌中将扩增的质粒提取出来。一般的大提质粒试剂盒都是使用纯化柱，提取出来的质粒纯度高，杂质少，无内毒素，一般用于细胞的转染等对质粒纯度高的实验。从200ml菌液中提取质粒，1000ul洗脱液洗脱后得到的质粒浓度为0.5-2ug/ul。维真生物慢病毒、腺相关病毒（AAV）包装一般使用大提试剂盒进行抽提，以保证高滴度及稳定的质量。 注：在一个细菌细胞中只有5个以下的相同质粒时，该质粒是低拷贝质粒；当在一个细菌细胞中可以有几百个相同质粒时则该质粒是高拷贝质粒。低拷贝质粒在等量的菌体中的数量远低于高拷贝质粒，因此用等量菌体提取质粒时，提取的低拷贝质粒的浓度会很低。维真生物的过表达载体是低拷贝质粒，对于此类质粒载体，若需要大量质粒或者小提质粒的实验效果不好时，则需要加大提取的菌体量，可进行质粒中提或者大提，另外，使用去内毒素的试剂盒抽提质粒时，也会降低最终得到质粒的浓度。 注：感受态菌株是模式菌株，没有质粒，是为了扩增目的质粒而生的，否则再转化进目的质粒后就会混合了。 质粒提取试剂盒选择 1、小提质粒：（特点）简单快速，可高通量提取 ；（浓度）100-200ng/ul；（用途）测序，PCR，腺病毒包装、多数细胞转染实验 2、中提质粒：（特点）质粒DNA量较高，（浓度）0.7-1ug/ul；（用途）测序，多数细胞转染实验 3、大提质粒：（特点）质粒DNA量非常高，杂质少，无内毒素（浓度）0.5-2ug/ul （用途）慢病毒、腺相关病毒包装，多数细胞转染或其他需要大量质粒的实验。 大多数试剂盒都是在碱裂解法的基础上优化改进的。 对于小量制备的质粒DNA， 经过苯酚、氯仿抽提，RNA 酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA 已可满足细菌转化、DNA 片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。 分享一种提取质粒的方法 试剂准备： 1. 溶液Ⅰ: 50mM 葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O 至500ml。在10 lbf/in2 高压灭菌15min ，贮存于4℃。 2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O 至10ml。使用前临时配置。 3. 溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O 至500ml。4℃保存备用。 4. TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O 至100ml。15 lbf/in2 高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。 5. 苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1） 6. 乙醇（无水乙醇、70%乙醇） 7. 5×TBE：Tris 碱54g， 硼 酸 27.5g，EDTA-Na2·2H2O 4.65g， 加 ddH2O 至1000ml。15 lbf/in2 高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。 8. 溴化乙锭（EB）：10mg/ml 9. RNase A（RNA 酶 A）：不含 DNA 酶(DNase-free) RNase A 的 10mg/ml，TE 配制，沸水加热15min，分装后贮存于-20℃。 10. 6×loading buffer（上样缓冲液）：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青 FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。 11. 1% 琼脂糖凝胶：称取1g 琼脂糖于三角烧瓶中，加100ml 0.5×TBE，微波炉加热至完全溶化，冷却至60℃左右，加 EB 母液（10mg/ml）至终浓度0.5μg/ml（注意：EB为强诱变剂，操作时带手套），轻轻摇匀。缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min 以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳缓冲液 0.5×TBE），即可上样。 操作步骤： 1. 挑取LB 固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0ml LB（含相应抗生素）液体培养基中，37℃、250g 振荡培养过夜（约 12-14hr）。 2. 取1.5ml 培养物入微量离心管中，室温离心8000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。 3. 将细菌沉淀重悬于100μl 预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。 4. 加 200μl 新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞膜裂解（溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。 5. 加入150μl 预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置3-5min。溶液Ⅲ为中和溶液，此时质粒 DNA 复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。 6. 加入450μl 的苯酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，4℃离心 12000g × 10min。 7. 小心移出上清于一新微量离心管中，加入2.5 倍体积预冷的无水乙醇，混匀， 室温放置 2-5min，4℃离心 12000g×15min。 8. 1ml 预冷的70%乙醇洗涤沉淀1-2 次，4℃离心 8000g×7min，弃上清，将沉淀在室温下晾干。 9. 沉淀溶于 20μl TE（含 RNase A 20μg/ml），37℃水浴 30min 以降解 RNA 分子，-20℃保存备用。 质粒DNA 的电泳检测： 观察琼脂凝胶中DNA 的最简单方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色。该物质含有一个可以嵌入DNA 的堆积碱基之间的一个平面基团，这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致染料与DNA 结合并呈现荧光，其荧光产率比游离染料溶液有所增加。 DNA 吸收254nm 处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身则在302nm 和366nm 有光吸收。这两种情况下，被吸收的能量可在可见光谱红橙区的590nm 处重新发射出来。因此，当凝胶中含有游离溴化乙锭时即可以检测到少量的DNA。 取制备的质粒DNA 1-2μl，加适当loading buffer 混匀上样,采用1-5V/cm 的电压，使DNA 分子从负极向正极移动至合适位置，取出凝胶置紫外灯下检测， 摄片。 注意事项： 本裂解法小量制备质粒DNA 重复性好，一般无麻烦。若所提取质粒DNA 不能被限制性内切酶切割，可通过酚/氯仿再次抽提，以清除杂质来解决问题。 质粒提取常见问题及解决方案 1、菌液较多：可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中。收集的菌体量以能够充分裂解为佳，菌体过多裂解不充分会降低质粒的提取效率。未彻底混匀的菌块会影响裂解，导致提取量和纯度偏低，菌体悬浮后若有较多的气泡也会影响裂解，导致导致提取量和纯度偏低。质粒提取使用的溶液I主要是悬浮菌体，溶液II裂解菌体，其中的高浓度NaOH破会细菌细胞壁和细胞膜，使菌体中的质粒DNA释放出来，溶液III主要是中和溶液，使溶液恢复中性环境，利于质粒DNA复性，溶液II中SDS的Na+会被K+置换，SDS变为PDS并结合大分子的基因组DNA,蛋白质和细胞碎片形成不溶物，然后通过离心可以得到含有质粒DNA的上清。因此加入溶液II后要温和地混合，不要剧烈震荡，以免使基因组DNA断裂污染质粒。所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。如果菌液没有变清亮，可能是由于菌体过多，裂解不彻底，若继续进行后续操作会得到鼻涕状的沉淀，无法通过离心分离得到含有DNA 的上清液，因此在加入溶液Ⅱ后菌液没有变清亮后可以适当按比例加大溶液Ⅱ和后续溶液Ⅲ的用量。 2、菌液培养时间：使用TB培养基培养菌液的时间一般在16小时左右，菌液OD值在2.5-2.6左右为佳，培养时间短会导致菌体生长不充分，培养时间过长菌体会出现死亡，导致活菌比例降低，进而基因组DNA污染概率增大。培养时间应优选的控制在12-16 h内。 3、宿主菌株：宿主菌株的种类将会影响质粒的收获量。含内源核酸酶的宿主菌株，HB101, 如JM101, JM110, TG1以及它们的衍生菌株，通常因为内源核酸酶的存在，或者在提取过程中释放出来的核酸酶的作用下，将会显著影响最终收获量，或者纯化到的质粒容易降解，推荐将质粒转化至不含内源核酸酶的宿主菌株中，如Top10, DH5a进行质粒纯化。 4、质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体，或者加大提取的菌液量，并减小洗脱时的体积。当所提取的质粒大于10 kb时，由于菌体承载力有限，大质粒复制效率往往会低于普通质粒，因此推荐增大菌液量以获得更好的提取产量。 5、菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。有时菌种保存一段时间后会出现质粒丢失的情况，导致无法提出质粒，若有保存的质粒可以转化后再挑取单克隆摇菌提质粒。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。 6、碱裂解不充分：使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加裂解液的用量。并确保细菌混悬均匀。菌体沉淀未能充分悬浮或悬浮后有较多气泡也会导致裂解不充分，要注意让菌体充分悬浮并将较多的气泡用移液器吸出。对低拷贝数质粒，提取时可加大菌体用量并加倍使用试剂盒溶液，可以有助于增加质粒提取量和提高质粒质量。 7、溶液使用不当：溶液II在温度较低时可能出现浑浊，可置于42℃水浴保温片刻直至溶解为清亮的溶液，方可使用。 8、吸附柱过载：不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。若用富集培养基，例如TB或2×YT，菌液体积必须减少;若质粒是非常高的拷贝数或宿主菌具有很高的生长率，则需减少LB培养液体积。 9、质粒未全部溶解(尤其质粒较大时) ：洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。 10、乙醇残留：漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，再加入洗脱缓冲液。漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，可置于室温静置20-30分钟，或放到超净台上风吹15分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 11、盐离子污染：当漂洗操作不当或漂洗不充分时将导致盐离子污染，该指标可通过OD260/230比值鉴定，通常大于2.0是可接受的。在使用试剂盒时应确保Wash Buffer的漂洗次数和漂洗液加入量。 11、洗脱液加入位置不正确：洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。若第一次没有将洗脱液准确加到硅胶膜的中心部位，可以离心后将离心下来的洗脱液按正确方式重新上柱再次洗脱。 12、洗脱液不合适：DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA，pH8.5)或水。洗脱效率还取决于pH值，最大洗脱效率在pH 7.0-8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内，如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60℃后使用，有利于提高洗脱效率。为追求高浓度质粒而减小洗脱液体积将会导致洗脱不充分进而降低产量，因此要确保洗脱液的用量，此外Elution Buffer预热至60℃和重复洗脱将更有利于洗脱效率提升。 13、洗脱体积太小：洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度降低。为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。 14、洗脱时间过短：洗脱时间对回收率也会有一定影响。洗脱时在说明书的建议时间基础上适当延长静置或者洗脱两次可达到较好的效果。 |
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