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超困困狗g

新虫 (小有名气)

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[交流] 分子生物学：PCR检测技术操作步骤

简单来说分为以下三个步骤：

✦

DNA变性，加热使靶DNA序列双链解离成单链DNA。

引物与靶DNA退火，适当降低温度，使两个引物分别结合成靶DNA两条的3′末端向5′末端延伸。

引物延伸，在DNA聚合酶的催化下，引物沿着靶DNA3′末端向5′末端延伸。新合成的DNA链在变性解离后，又可作为模板与引物杂交，并且在DNA聚合酶的催化下，引导合成新的靶DNA链。如此反复进行以上3个步骤，即可使靶DNA片段指数性扩增。

具体操作步骤如下：

✦

1.在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。

10×PCR buffer

5 μl    dNTP mix （2mM）

4 μl    引物1（10pM）

2 μl    引物2（10pM）

2 μl    Taq酶（2U/μl）

1 μl    DNA模板（50ng-1μg/μl）

1 μl    加ddH2O至 50 μl

视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。

2.调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，最后在72℃ 保温7min。

3.结束反应。PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。

4.PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μl氯仿进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。

虽然，PCR技术已经相当成熟，但对于一个传统实验室，不但要满足高科技的实验设备，合理的空间布局等基本条件，一般还具有人员素质专业性高、管理严谨度高、投入成本高、结果责任性高等特点。

END

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1楼 2024-04-28 15:07:10

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