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一种研究RNA与蛋白质的相互作用的实验方法
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种研究RNA与蛋白质的相互作用的实验方法 RIP是指RNA Binding Protein Immunoprecipitation，同RNA pulldown相似，也是一种研究RNA和蛋白相互作用的方法，但与RNA pulldown的出发点不同， RIP是从蛋白出发研究蛋白RNA相互作用的技术。就是已知一个蛋白，把与蛋白结合的RNA富集出来并鉴定，以证实蛋白与RNA间的互作。 RIP 的基本原理 用抗体捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白。 免疫沉淀把RNA结合蛋白及其结合的RNA一起分离出来。 结合的RNA序列通过定量RT-PCR或高通量测序（RIP-Seq）方法来鉴定。 实验方法 01 蛋白A琼脂糖凝胶和抗体的固定 取被protein-A包裹的磁珠悬浮液，先用PBS洗涤，然后用NT2缓冲液洗涤磁珠两次。 将NT2缓冲液和BSA添加到磁珠悬浮液中，在室温下搅拌培养2小时。 将抗体添加到上述步骤得到的混合物中，然后在室温下孵育1小时。 用NT2缓冲液洗涤protein-A包被的磁珠，然后搅拌3min，1000g，离心1min，重复此过程5次。 02 细胞裂解物的制备 将细胞先转移至离心管，然后在4℃，1000g，离心10min； 细胞用预冷的PBS洗涤两次； 加入与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞，轻轻地吹打均匀于冰上静置5min； 每管分装400 μL细胞裂解液，于-80℃冰箱保存； 03 免疫沉淀反应 将上述步骤得到的细胞裂解液4 °C，14000 g，离心10 min； 取清液到一个新的离心管中，4 °C，14000 g，离心5 min，再将上清液再转移至另一个新的管子中； 在制备的上清液中加入10倍体积的NET-2buffer重悬的磁珠，吹打混匀； 取约10%的样品作为“Input”备份，−80 °C保存备用； 在裂解液中加入10倍体积的NET-2 buffer重悬的磁珠，作为阴性对照； 接着在4℃恒温搅拌下孵育12-16h； 孵育后，离心分离protein-A包被的磁珠，取出10%上清备份“output”； 用NT2缓冲液洗涤磁珠，将其重悬后并混合3min，然后4℃，1000 g离心，重复6次。 RNA的分离与分析 将Trizol加入到等体积的磁珠中，并将混合物重新悬浮，RNA立即被分离或冷冻在液氮中。 检测RNA的浓度和质量，并通过RT-PCR和测序鉴定RNA. RIP实验中常见问题及解决办法 非特异性RNA的结合过高 在室温下搅拌培养2小时，可以减少mRNA与磁珠的非特异性相互作用。 分离得到的RNA水平过低 实验过程中需确保细胞中有足够水平的蛋白质。 |
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