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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 请问如何科学计算酶突变体前后酶活的变化值
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秦风拂面

新虫 (初入文坛)

[求助] 请问如何科学计算酶突变体前后酶活的变化值 已有1人参与

大家好，向大家请教一个问题:
       鄙人最近在做酶的定向改造，需要对氨基酸序列中某些氨基酸残基进行定点突变，以提高其催化活性，酶是通过胞外异源表达得到的。
       但是考虑到通过发酵产酶，发酵液中的蛋白质含量受到发酵时间、接种量以及菌种状态等因素的影响，无法保证野生型菌株和突变体菌株发酵液中单位体积所含重组蛋白质量的一致性，所以无法直接通过测定发酵液中的酶活，来比较突变体菌株所产酶活的变化，也就是不知道怎么保持突变前后测定条件的一致性。
        所以想向大家请教一下，应该怎么科学地比较突变体酶活相对野生型菌株的变化值，这个问题最近困扰我很久了，求好心的大佬赐教。

@wizardfan @biostar2009 发自小木虫Android客户端
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1楼 2024-04-11 20:35:07
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如果能把蛋白纯化出来，用同样的量进行对比野生型与突变性，这样比较能证明是蛋白的表观活性变化（还有可能是其他原因）。

否则可能是突变蛋白表达量提升了，或者突变蛋白稳定性不好，或者其他原因，导致突变体或野生型在粗酶液中活性差异。

折中的做法是仍然用粗酶液，电泳做western，用western定量来校准粗酶液中的目的蛋白，工作量其实也不小。
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秦风拂面
行至水穷处，坐看云起时
2楼2024-04-14 09:50:22
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秦风拂面

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by pennchem at 2024-04-14 09:50:22
如果能把蛋白纯化出来，用同样的量进行对比野生型与突变性，这样比较能证明是蛋白的表观活性变化（还有可能是其他原因）。

否则可能是突变蛋白表达量提升了，或者突变蛋白稳定性不好，或者其他原因，导致突变体或 ...

好的，谢谢你，不好意思，最近有点忙，我都忘了我提过问了。最后再次表示感谢

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3楼2024-05-07 21:15:47
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