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科研战神·王

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[交流] 菌种保藏的常见方法汇总

菌种保藏的常见方法汇总

菌种保藏是指保持微生物菌株的活力和遗传性状的技术。微生物在使用和传代过程中容易发生污染、变异甚至死亡，因而常常造成菌种的衰退。菌种保藏的目的就是使菌株存活、不丢失、不污染杂菌、不发生或少发生变异，保持菌种原有的活性和各种特征。菌种保藏的基本原理是使微生物的生命活动处于半永jiu性的休眠状态，也就是将微生物的新陈代谢作用限制在最低范围内。

实验室常用的保菌方法有：甘油保菌法、斜面保菌法、穿刺保菌法、液体石蜡覆盖保藏法、沙土保藏法、冷冻干燥法。微基生物在以上几种菌种保藏方法的基础上，开发出了保菌效果更好瓷珠保菌法。

一、甘油保菌法

此方法适用于菌种的中长期保藏，保藏时间可在1年以上。由于甘油本身十分粘稠，很难定量，因此一般将甘油和生理盐水按1:1的比例配成终浓度为50%的甘油溶液。使用时，按50%甘油：菌液=1:1的比例混合，使甘油终浓度在20-30%即可，甘油浓度过高或过低都不利于菌种保藏。将甘油菌种转移至-80℃冰箱长期冻存。需要取用菌种的时候，将冻存管放在37℃水浴中快速解冻，直到菌种完全融化，此时可取出菌种进行实验。

此方法适用范围广，操作简单，保藏期长，菌种不容易发生变异。

二、斜面保菌法

将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后转移至4℃冰箱中保藏。保藏的时间根据微生物的种类而不同，一般霉菌、放线菌及产芽孢的细菌保存2-4个月就需要移种一次，酵母菌为两个月，而细菌最好一个月移种一次。需要取用菌种的时候，可用接种环在斜面上挑取少量菌体进行接种。

此方法的优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异或污染杂菌等。缺点是保藏期短，菌种容易变异，因为培养基的物理和化学性质不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢发生改变，且此方法污染杂菌的机会较高。

三、穿刺保菌法

准备一管半固体培养基，用接种针挑取菌种，自半固体培养基的中心垂直刺入，直至接近试管底部，但不要穿透，然后沿原穿刺线将接种针退出，于4℃冰箱保存。此方法同斜面保菌法一样需要定期移种。

四、液体石蜡覆盖保藏法

此方法是斜面保菌的辅助方法。将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后注入无菌液体石蜡，使其覆盖整个斜面，再直立放置在4℃冰箱中保藏。液体石蜡可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，同时可以让菌体与空气隔绝，减弱菌种的代谢作用，延长保藏时间。需要取用菌种时，用接种环从斜面上挑取少量菌种即可。

此方法的优点是操作简单，不需要特殊的设备，且不需要频繁移种，保藏时间较长。缺点是保存时必须直立放置，占用空间较大。

五、沙土保藏法

将培养好的菌种与无菌沙土混合，使菌体吸附在沙土载体上，干燥后转移至4℃冰箱保存。需要取用菌种的时候，取出少量沙土颗粒即可。

此方法操作简单，菌种的保藏时间长。

六、冷冻干燥法

将菌种冷冻，在减压下利用升华作用去除水分，使细胞的生理活动趋于停止，从而使菌种长期维持存活的状态。需要取用菌种的时候，用无菌水或培养基重悬菌体，将菌悬液转移至固体培养基平板上进行培养。

此方法适用于菌体的长期保存，但是相关的设备和操作相对其他几种保藏方法都比较复杂。

七、瓷珠保菌法

微基生物在以上几种保藏方法的基础上开发出了瓷珠保菌法，相对传统的保藏方法保菌的效果更好，而且取用方便，可降低菌种因反复冻融而受到的伤害。

瓷珠冻存管中包含12颗磨砂瓷珠和菌种保存液。挑取对数生长期的菌种转移至冻存管中，上下颠倒混匀，此时菌种会均匀分布在保存液中。用移液器吸出保存液，此时在表面张力的作用下，每颗瓷珠表面都会覆盖一层保存液，而菌种就保存在这层保存液中。将含有菌种的冻存管转移至-80℃冰箱即可长期冻存（一般可保存约1年）。

需要取用菌种时，从-80℃冰箱中取出冻存管，轻轻摇晃使瓷珠分散开，挑取一颗瓷珠接种至培养基平板上进行划线培养，或接种至液体培养基中进行摇菌培养。接种完成后，迅速将冻存管放回冰箱中。

针对厌氧菌株，我们也能够提供含有还原剂的厌氧性保存液，并对菌种采用真空包装，避免菌种因接触氧气而死亡。

菌种保藏的方法很多，但原理大同小异。

首先要挑选优良纯种。利用微生物的孢子、芽孢及营养体；

其次，根据其生理、生化性，人为创造低温、干燥或缺氧等条件，抑制微生物的代谢作用，使其生命活动降低到极低的程度或处于休眠状态，从而延长菌种生命以及使菌种保持原有的形状，防止变异。不管采用哪种保藏方法，在菌种保存过程中要求不死亡、不污染杂菌和不退化。

短期：斜面保藏

斜面保藏是目前最普遍的短期保藏法，操作简单，使用方便，但需定期接种。因此工作量较大，而且传代次数多易发生变异，因此，仅适用于短期经常使用的菌种。

1. 配制培养基，营养成分浓度稍低为宜，特别是糖类尽可能降低，产酸菌种，则应添加少量碳酸钙；

2. 斜面装液量，斜面以倾斜后不超过试管长度1/2为宜；

3. 斜面培养，温度较最适稍低，时间较最适略长；

4. 生长完成后，密封置于2~8℃的冰箱中保藏。每传代一次，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌可保存1~3个月，酵母菌2个月，细菌1个月。

活化使用：

将斜面从冰箱中取出，细菌挑取菌落增菌，或霉菌切块传代培养，培养好即可使用。

长期：冷冻保藏

冷冻保藏是目前使用较为广泛的长期保藏法之一，适用于所各类微生物，较之于斜面保藏，减少了工作量，延长了保藏时间。

1. 准备斜面或平板新鲜培养物一个，10%的无菌甘油溶液；

2. 用甘油溶液将菌体或孢子洗脱下来，形成菌悬液；

3. 菌悬液分装，冻存管装液1mL/支，后置于程序降温盒；

4. 将程序降温盒置于-80℃冰箱冻存；

5. 可保藏1-2年。

活化使用：

1. 将冻存菌株置于冻存盒中取出，准备水浴溶解，切勿常温融化；

2. 将菌株迅速置于水浴速溶，细菌40℃，真菌30℃，约 2min全部溶解后接种到适宜培养基；

3. 采用适宜条件培养完成即可。

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