| 查看: 1129 | 回复: 0 | |||
[交流]
荧光素酶互补（Luc）实验
|
|
【导入】基于荧光素酶（Luciferase）的发光原理，形成了双荧光素酶报告基因检测系统。该系统包括萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase）和海参荧光素酶（Renilla luciferase）。两者可与各自的底物发生氧化作用产生生物荧光，产生的荧光值即表示两种酶的表达量多少。 Firefly luciferase和Renilla luciferase被称为报告基因，是因为在表达调控研究时，利用两者表达产生的荧光比值可监控微观层面上的分子间相互作用。 具体做法：将靶基因的的转录调控元件或5'启动子区融合在Firefly luciferase基因的上游，把3‘-UTR区或IncRNA序列融合在Firefly luciferase基因的下游，以研究启动子的强弱和转录因子对启动子的作用，或miRNA对目的基因/IncRNA的调控作用。 该系统中引入Renilla luciferase基因的TK载体作为内参，以消除细胞转染等因素带来的组间误差。 其中luciferase来源于细菌、萤火虫和发光海洋生物等，可以在哺乳动物细胞和植物细胞中直接表达，无需表达后修饰，直接具备完全酶活性。 与GFP不同之处在于luciferase的发光检测不需要激发光激发，且发光穿透力更强，这使得Luc实验具备可定量、高灵敏度及背景低等特点。 【利用荧光素酶互补实验验证植物蛋白互作】 基本原理 在验证植物蛋白互作时，荧光素酶互补实验 (Luciferase Complementation Assay, LCA) 因其高灵敏度、可定量化、操作简单高效被广泛应用于植物学和动物学蛋白质互作研究。 目前, 应用最为广泛的荧火素酶基因来源于北美萤火虫 (firefly luciferase), 该基因编码550个氨基酸组成的荧火素酶蛋白 (大小为62 kDa)。 实验中, 荧光素酶蛋白被切成 N端 和 C端 2个功能片段, 即 NLuc (2–416AA) 和 CLuc (398–550AA) 。 在一个实验体系中, 待检测的2个目标蛋白分别与NLuc和CLuc融合, 如果2个目标蛋白相互作用, 则荧火素酶的NLuc和CLuc在空间上会足够靠近并正确组装, 从而发挥荧火素酶活性, 即分解底物产生荧光 。 实验过程 将含有融合蛋白的植物表达载体转化农杆菌 (Agrobacterium) 后注射烟草叶片。24–48小时后，加入反应底物荧火素, 利用植物活体分子影像系统 (CCD imaging system) 或luminometer来定性定量检测荧光强度, 以判定目标蛋白之间是否存在相互作用及互作的程度。 毕合生物（www.bihebio.com)提供服务内容：分子生物学、免疫, 重组蛋白及ELISA相关、活性小分子化合物、高端化学、材料化学、细胞资源库与培养相关、生命科学、天然产物 |
回复此楼» 猜你喜欢
一志愿东华大学化学070300，求调剂
已经有8人回复
-
277材料科学与工程080500求调剂
已经有7人回复
-
317求调剂
已经有18人回复
-
293求调剂
已经有5人回复
-
280分求调剂 一志愿085802
已经有7人回复
-
0854电子信息求调剂
已经有3人回复
-
263求调剂
已经有4人回复
-
石河子大学（211、双一流）硕博研究生长期招生公告
已经有3人回复
-
一志愿西安交通大学材料工程专业 282分求调剂
已经有13人回复
-
北科281学硕材料求调剂
已经有6人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
