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疯狂修行者木虫 (正式写手)
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[交流]
求助：变性PAGE与非变性PAGE的区别？
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| 最近刚刚学着做AFLP，要做PAGE，可是发现PAGE电泳分变性PAGE与非变性PAGE，文献报道中用的也不一样，不知道：加过变性剂的PAGE和不加变性剂的PAGE有什么不同，什么时候加变性剂，什么时候不加？望大侠们不吝赐教！！ |
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木虫 (正式写手)
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变性PAGE，一般是PAGE胶中加入尿素（核酸检测）作为变性剂（蛋白质电泳时用SDS，即SDS-PAGE），上样时PCR扩增产物95℃变性，loading buffer中有去离子甲酰胺（有毒，尤其是对男性）作为变性剂。DNA条带以单链的形式存在、分离，具有很高的分辨率，适用于AFLP/SSR等分子标记的产物检测，可以较灵敏地反映条带的多态性。电泳时需要高电压、低电流、恒功率以保证条带的分离。 非变性PAGE，相比较变性PAGE，分辨率较低，电泳时电压较低（具体参数可参考分子克隆指南），电泳时间很长。一般用于SSR/ISSR等标记的检测。 楼主的AFLP用5~6%PAGE胶即可。 注意AFLP的酶切、预扩产物的稀释。 另外，不知楼主做什么材料、利用AFLP研究哪方面的内容，最近MFLP技术也开始应用起来了。可以参考一下。 |
3楼2009-10-21 17:04:07
gyesang
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前几天也一直找这方面的东西，至今没有找到关于变性和非变性的区别，二者有什么不同，各有什么优点有缺点。也看了一点资料，下面是我个人的理解，仅供参考，有什么好的想法希望积极交流： 1. 变形和非变性用途有不同，跑变性胶，DNA被变性为单链，一般是尿素也有用甲酰胺的，主要被用来纯化同位素标记的探针，DNA测序，分析核酸酶S1降解产物；而非变性胶主要用来检测DNA-Protein相互作用如EMSA，制备高纯度DNA片段 2. 变形和非变性电泳时，DNA的泳动方式不同，变性胶电泳时，与DNA单链的碱基组成和序列关系不大，只与DNA分子大小有关系，带的迁移与分子大小成比例，而且不会受DNA分子构象的影响，能区分杂合和存合的双链；而非变性胶，分离双链DNA是跟其大小有关，分离单链是与其单链DNA是与其大小和构象有关(这里非变形可以跑双链也可以跑单链，变性胶一般会把DNA裂解成单链) 另外再附上摘自《微卫星PCR产物变性与非变性PAGE-银染检测方法的比较》论文中得到的结论： 1. 由于DNA复制时链的滑移造成所扩增片段与实际的微卫星片段小一个重复单位，因此无论是变性还是非变性胶，在主带前面都会有一条相距很近的非特异带。 2. 非变性胶中，有较多的非特异条带的出现；变性胶中，由于DNA以单链形式存在，并且不形成二级结构，因此条带能反映真实的微卫星扩增结果，不受其碱基组成的影响。 3. 如果PCR产物的两条互补链分子量相近，在变性胶中纯合子为单带，杂合子为双带；如果两条互补链分子量相差较大，在变性较中纯合子为双带，杂合子为4条带。 |
2楼2009-10-21 14:45:23
yzhang1986
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4楼2009-10-21 18:21:48
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