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鸿雁8506金虫 (小有名气)
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急：请教组培污染原因！
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10月10日做第一批，第二批组培外植体初代培养实验，10月11日做第三批；10月17日，18日分别做了第四批，第五批 每一次都污染特别严重，分别是不同的同学做的。开始我们以为是组培室不干净导致的，彻底打扫后还是大片污染，后来老师说是操作消毒的问题。 材料分别经75%乙醇消毒7-8秒，无菌水清洗，0.1%升汞消毒3-4分钟，无菌水漂洗3次。 据老师的说法是我们把灼烧后的镊子放到无菌水冷却，导致交叉污染了。此外，由于学生人数多，难免有其他一些不规范的操作，如手拿出操作台后未用酒精擦拭又放回去。 但是9月初我们做过好几批，污染率都比较小，操作和上面的差不多。而出现大面积污染后，有两三个同学（9月份他们做的污染很小）根据老师的提醒单独操作了几次，污染还是很严重，不知道到底是什么原因？是否和10月份的材料有关？这样连续做下去我们都没信心了。 希望有经验的高手给与指点，谢谢了！ |
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dingqian03
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鸿雁8506(金币+3,VIP+0): 10-21 14:07
amisking(金币+3,VIP+0): 10-22 12:29
鸿雁8506(金币+3,VIP+0): 10-21 14:07
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现在许多科研单位和花木生产企业都已配置了组织培养室。组培技术已成为重要的生物技术之一。然而有的组培室组培苗的数量和质量却一直没有质的飞跃，究其原因，最主要的因素就是污染所造成的。被污染后首先是生产成本的提高；其二，对植株造成伤害；其三，增加接种源受污染的机率。 常见污染源 组织培养过程中的污染源主要有以下几种：（1）户外风大，菌类进屋机会多。有风就有沙，有沙就有尘，有尘就有菌，菌尘共存，这是菌类进屋的主要原因之一。（2）屋内太潮，菌类繁衍多。需保持室内空气干燥，如使用空调“除湿”功能，也可减少真菌生长繁殖。（3）人员带菌多。在整个操作室内，人员可说是最大的带菌者，不管在毛发或是衣服等地方，都隐藏着数不清的菌类。在进入操作室前，最好能对作业人员进行清洁处理，比如换上干净的白大褂，换上实验室的鞋，衣服鞋每星期洗一次，上超净台前手要用肥皂清洗两遍，接种前手再用酒精擦拭一遍。（4）屋内不干净。紫外线能杀灭或抑制真菌生长，因此应在每次接种前进行20分钟的紫外灯消毒。（5）清理屋内带菌组培苗。在植物病害中，真菌所引起的病害尤其严重，且因会产生孢子，随着空气飘散。一旦落入适当的环境下，一粒小小的孢子便会扩大成一个菌落，污染整个组织培养瓶。因此一旦有真菌污染的组培苗，就要用高压灭菌器彻底消灭，以防扩散。（6）接种不正确。不正确操作也会增加污染机率，如开盖太快，灭菌不够，操作过慢等。接种过程应该轻开盖，快操作。 污染原因及污染苗抢救 若污染菌类是零星分散在培养基中，则可确定是人为引起的污染，比如培养基灭菌不彻底；超净工作台长时间不换滤网，致使净化能力降低；接种用具灭菌不彻底；操作不正确，动作生硬缓慢，开瓶时间太久，接种台摆放物品杂乱，操作中心在人体范围之内；接种室长期不灭菌，菌类太多等。 若污染菌类是从材料周围长起，则可证明是植物材料带菌引起。可能是接种用具灭菌不彻底，接种时材料被污染；或者是未及时发现污染苗，接种过程交叉感染等。 若菌类从材料培养基以上部分长起，而不是从培养基先长起，且发生在5天以后，则说明是材料带的内生菌。若从培养基以下开始长菌，发生时间较早，且有从里向外的趋势，则说明是切口引起的污染，原因可能是灭完菌后，未剪去两个切口或虽剪但器具带菌。 真菌污染后，如果已形成孢子，则必须经高压灭菌后扔掉，即使仅形成菌丝也应处理后扔掉，因为菌丝能够达到材料内部，因此，真菌污染是灭绝性的。如果是细菌污染，由于细菌繁殖是靠芽孢，细菌不会弥散在整个空间，因此只要及时发现，可将材料上部未感菌的部分剪下转接，材料仍可以用。 用抗生素等杀菌药剂进行处理，这种方式虽有不少报道，但至今还未发现那种抗生素能够对各种菌都有效，并且也会影响植物材料的正常生长分化。还有一些药剂虽然杀菌效果好，但往往容易引起盐害，也无法利用。 看看这些是否有用 |
2楼2009-10-21 08:44:02
dingqian03
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污染原因（从病原菌分析） 1．细菌污染：菌斑呈黏粘液状，界限比较明显，一般接种后1—2天即能发现。主要是大肠杆菌和链球菌。 2．真菌污染：菌斑呈绒毛状、絮状，界限不明显，伴有不同颜色的孢子接种后3—10天才能发现。主要是霉菌污染。 污染途径： 1．外植体带菌 2．培养基及接种器具灭菌不彻底 3．接种操作是带入 4．环境不清洁 污染的预防措施： （一） 防止外植体带菌 1． 选择好外植体采集时期和采集部位 ● 外植体采集以春秋为宜； ● 优先选择地上部分作为外植体； ● 阴雨天勿采，晴天下午采集； ● 采前喷杀虫剂、杀菌剂或套塑料袋。 2． 室内或无菌条件下进行预培养。 3． 外植体严格灭菌 灭菌效果实验 多次灭菌和交替灭菌 （二） 保证培养基及接种器具彻底灭菌 1． 分装时，注射器勿触瓶口。培养基勿粘瓶口 2． 检查封口膜是否破损 3． 扎瓶口要位置适当，松紧适宜 4． 保证灭菌时间和高压锅内温度 5． 接种工具用前彻底灭菌 6． 工作服、口罩、帽子等布质品定期进行湿热灭菌 （三）操作人员严格遵守无菌操作规程 （四） 保证接种与培养环境清洁 1． 污染瓶经高压灭菌后再清洗 2． 接种环境定期熏蒸消毒、紫外灯照射，或用臭氧灭菌机消毒 3． 定期清洗或更换超净台初过滤器，进行带菌实验；接种前15—20min打开风机，风速调整到20——30m/min，并对台面用75%酒精喷雾消毒 4． 定期对培养室消毒，防止高温 污染的原因及其控制(视频)下载: http://www.lnnzy.ln.cn/kejian/swjsx2/wuran.rmvb 这上面有视频，你去看看自己哪一步出问题了，要是都没问题不可能污染那么严重 |
3楼2009-10-21 08:45:20
lclimeifan
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不知道你做的是啥材料的外植体？？一般外植体的消毒都不容易，升汞时间长了易变黑死亡，短了易污染。 我估计你们污染的主要原因还是外植体消毒的问题，再就是最好减少操作的人数，人多手杂。再有操作过程中手拿出操作台个人感觉跟污染关系不大。灼烧后的镊子放到无菌水冷却？？？为甚莫要这样做呢？？放着自然冷却就行了。 建议：彻底对蒸馏水灭菌并保证无菌； 操作用的镊子，烧杯，剪刀，滤纸等器材彻底灭菌； 操作前外植体进行洗衣粉或者洗涤剂水泡，流水冲洗。可用次氯酸和升汞 混合灭菌。 操作前清洁操作台，紫外照射。 祝成功！！ |
8楼2009-10-21 21:05:55
rosalie161
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