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模型鼠之急性肾损伤动物模型
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AKI 是一种多学科的临床常见危重病症，病因复杂，涉及脓毒血症、血液动力学异常、肾毒性等因素。 AKI动物模型的建立方法较多，从机制上可分为中毒性（药物诱导）AKI动物、缺血性AKI动物模型两类。 药物诱导模型的方法包括：顺铂、氨基糖甙类抗生素、阿霉素、氯化汞、氟化钠等方法。 缺血性 AKI 模型方法包括：一侧肾缺血/再灌注加对侧肾切除法、双侧肾蒂夹闭法、注射甘油法、去甲肾上腺素滴注法、油酸法等。 应用动物有猪、犬、兔、大鼠、小鼠等。 缺血性AKI模型 缺血性肾损伤是 AKI 中最常见的类型，建立合适的缺血性 AKI 动物模型有利于对该病的病理机制与治疗方法的深入研究。 目前缺血性 AKI 动物模型的常见制模方法包括血流阻断法、低灌注法、药物注射法、挤压法、远端器官缺血诱导法等。 1、血流阻断法 1.1 双侧肾动脉夹闭法（双侧肾蒂钳闭法） 双侧肾动脉夹闭法是目前国内最常用的缺血性 AKI 动物制模方法。 制模方法举例： 以雄性 SD 大鼠为例，麻醉后行腹部正中切口，找到肾蒂后进行钝性分离，用无损伤微型动脉夹迅速阻断双侧肾动脉（30、45、60 min），肾脏色泽由红色变为紫暗后松开血管夹，肾脏颜色由黑色逐渐转为红色，说明建模成功。 研究表明，肾脏缺血时间与损伤程度成正比，通过控制肾动脉夹闭时间可建立肾脏中度（夹闭肾动脉 20 min）或严重（夹闭肾动脉≥30 min）损伤的 AKI 模型。如果双侧肾脏缺血时间过长，肾脏受损严重，动物存活时间将会缩短，因此，合理控制肾脏缺血时间对成功制备 AKI 模型至关重要。 由于分离肾动脉的过程复杂，有学者提出了肾动静脉结扎法（结扎肾蒂）。结扎肾动静脉导致血肌酐（SCr）、血尿素氮（BUN）持续升高，并明显高于单纯结扎肾动脉，且操作过程更加简洁。 双侧肾动脉夹闭法操作简便、快速，是目前最常用的 AKI 制模方法，但夹闭肾动脉的同时也容易导致动物血压的波动，增加手术创伤和术后感的可能。 1.2 单侧肾 I/R 法： 制模方法举例： 采用腹部旁正中切口，分离并夹闭大鼠左肾动脉，至肾脏表面由亮红色变为红棕色，即实现了肾动脉完全性夹闭；45 min 后取下血管夹，观察到肾脏恢复至亮红色，即实现了再灌注，随后缝合切口。肾组织病理学观察结果提示，左侧肾小管扩张、上皮细胞空泡形成及脱落，肾间质水肿及炎性细胞浸润；扩散加权成像提示，左侧肾脏表观扩散系数降低，同时左侧肾外髓外带中损伤最明显。 采用单侧肾I/R法制备AKI模型，发现3h即出现明显的肾小管损伤，SCr 和 BUN 开始升高，并随着时间延长损伤逐渐加重，48 h 达到高峰，提示肾脏损伤程度与 I/R 时间呈正相关。 由于健侧肾脏的代偿作用，动物短期死亡率低，更适用于缺血性肾损伤引起的肾脏纤维化或硬化等远期损伤研究；同时，健侧肾脏的代偿作用也会导致肾功能指标不能有效反映患侧肾损伤程度，因此体外监测肾功能变化颇有难度。 1.3 一侧肾 I/R 联合对侧肾切除法： 一侧肾 I/R 联合对侧肾切除是建立急性肾 I/R 损伤十分常用的方法，且动物模型稳定、典型。 制模方法举例： 麻醉小鼠后行腹正中切口，暴露右侧肾蒂行右肾切除术，用非创伤性微血管钳分离左侧肾蒂并夹闭 30 min 后，恢复灌注，确保回流后再观察 5 min，经腹部注入 8 mL/kg 生理盐水后缝合切口，成功建立了 AKI 模型。有学者夹闭动物肾动脉 45 min 或 60 min 后恢复灌注也可成功制模，且夹闭时间越长，肾损伤越严重。 该制模方法造成的病理学损伤较双侧肾蒂钳闭法更显著，且呈更明显的渐进性变化，但实验过程涉及肾脏切除，对操作者的技术要求更加严格。 2、低灌注法 2.1 腹主动脉结扎法 腹主动脉结扎法属于低灌注法之一。 制模方法举例： 麻醉动物后，经右股动脉插入导管监测血压；行腹部正中切口，切除右肾；在肠系膜上动脉及左肾动脉之间的腹主动脉下穿入一条缝线，将缝线两端合拢并沿同一方向旋转，逐渐压迫腹主动脉，保持沿股动脉导管测得的血压为 20.3～24.8 mmHg（1 mmHg＝0.133 kPa），维持肾脏低灌注1 h 后解除压迫；制模后可见 SCr 升高。亦有学者通过夹闭大鼠肾下腹主动脉120 min、再灌注120 min成功建立AKI模型。 临床上缺血性 AKI 多继发于肾脏持续低灌注，通过结扎肾下腹主动脉引起肾脏缺血缺氧，再灌注时伴随大量氧自由基流经肾脏，造成肾脏急性损伤。该制模方法可用于模拟血流低灌注状态下的肾损伤，与临床患者病情更为贴近。 2.2 双侧肾动脉不完全结扎法 临床上极少由于肾血流完全阻断造成肾缺血损伤，故有学者提出了肾动脉不完全结扎法。 制模方法举例： 麻醉后行腹部正中切口，分离两侧肾动脉，用结扎线将直径 0.90 mm 的渔线分别与左、右肾动脉一起结扎，随即抽出渔线，完成双侧肾动脉不完全结扎；20 min 后松解结扎线，恢复肾血流。 研究发现，双侧肾动脉不完全结扎后，动物肾血流和尿量均减少，SCr 升高；同时血 K+ 升高，pH 值、HCO3- 及剩余碱（BE）降低。 该制模方法体现了肾缺血因素在 AKI 发生及治疗方面的临床意义。 2.3 失血性休克法 失血性休克法是一种利用大量失血导致周围循环障碍，肾脏持续低灌注、缺血诱导AKI的方法，可分为定容量型和定压型。 ① 定容量型模型以失血量达到动物体重或总血量的百分比为目标。 ② 定压型模型以血压下降为目标。 失血性休克法制备 AKI 模型需要在制模中密切监测动物的血压及体温，手术过程较复杂，存在较多不稳定因素，如动物体温、血液流动性等，对操作能力及实验条件要求较高。 此外，采用中度失血联合肾蒂夹闭也可成功制备失血性休克致 AKI 模型。 该制模方法可用于模拟临床失血性休克导致 AKI的病理生理机制，操作简单，重复性高，可有效减少循环血容量，同时可避免繁琐的手术操作及密切的血流动力学监测。 3、远端器官缺血诱导法 远端器官缺血诱导法是一种多用在肝、肠等远端器官因 I/R 损伤引起的缺血性 AKI 动物模型制备方法。肝、肠等远端器官 I/R 的同时，导致肾脏灌注不足，GFR 降低，引发 AKI；同时产生酸性代谢产物、内毒素、过氧化产物及炎 性介质等有害物质，引起氧化应激与炎症反应，导致肾脏发生急性功能损害。 该制模方法可用于模拟远端器官损伤导致 ARF 的病理生理状态，但肝、肠等器官缺血损伤可引发多器官功能障碍，肾损伤程度无法准确把控，故实际操作具有一定难度。 4、药物注射法 4.1 油酸注射法 油酸是一种具有较强毒性作用的脂肪酸，进入机体组织后可形成脂肪栓塞，引起肾小球毛细血管内皮细胞和系膜细胞肿胀、退变，导致肾血管内径缩小，血流阻力增大，肾组织血流灌注不足，微循环障碍，肾实质细胞缺血缺氧，引起 AKI。 方法举例： 麻醉 Wistar 大鼠后行腹部正中切口，分离左肾动脉，经左肾动脉注射 0.15 mL/kg 油酸，发现注射油酸 10 min、6 h、24 h 肾组织明显缺血，肾内小动脉收缩，血管内皮损伤，肾小管坏死，血浆 BUN、SCr 升高，脂肪栓塞，提示制模成功。 该制模方法操作简单，病程稳定，肾组织结构改变随注射油酸剂量和时间不同而变化，便于动态观察，适用于肾微循环研究，也可用于模拟起源于肾微循环障碍的缺血性 AKI，但油酸具有较强毒性，对机体损害较大，易并发其他器官损害，不利于临床药物筛选研究，使用较少。 4.2 去甲肾上腺素（NE）注射法 NE可引起肾血管收缩，肾小球血流量减少，肾实质缺血缺氧，导致 GFR 降低，引起缺血性 AKI。由于灌注不足，导致肾组织缺血缺氧，进一步加重肾损伤。 制模方法举例： 选取雄性健康犬作为实验动物，实验前充分禁食高蛋白饮食；麻醉后，从一侧肾动脉以0.75 μg·kg-1·min-1 的速度连续滴注 NE 40 min 引起肾血流量急剧下降，同侧输尿管收集的尿量相应减少，连续检测提示 SCr、BUN 升高，CCr、GFR 下降，近曲小管广泛坏死，肾小管上皮细胞变扁平，提示制模成功。 该制模方法动物模型病程稳定，成功率高，并且易于采血，能连续进行血液指标检测，动态了解药物作用时间与特点，但费用较高，并要并要求研究者熟练掌握手术操作，主要用于较大的动物模型。 5、挤压法 挤压法是一种物理制模方法，利用局部放血挤压制备缺血性 AKI 模型。制模方法。 制模方法举例： 动物于实验前 3 d 禁食盐，实验当日早晨禁食，实验前放血 8 mL/kg；实验中取俯卧位，根据体重选取不同压力，持续挤压双后肢 5 h；挤压后 1～3 d血浆 BUN、SCr 均明显上升，尿量、CCr 及 GFR 等均明显下降，提示制模成功。家兔经禁食、放血和挤压处理后，被挤压组织形成局部水肿，导致全身血容量不足，肾脏血流灌注不足，肾实质缺血缺氧，超微结构改变，肾脏毛细血管腔狭窄，进而引起肾小球滤过功能下降，造成缺血性 AKI。 该制模方法属于单一因素，可通过观察肾小球超微结构及血液流变学变化研究缺血性 AKI的发病机制，但动物存在个体差异，稳定性差，难以建立典型的 AKI 动物模型，现阶段应用较少。 二、药物诱导模型 药物引发的肾毒性、急性细菌感染造成肾脏细胞损伤、横纹肌溶解所致AKI。 1、阿霉素致大鼠、小鼠 AKI 模型 阿霉素也叫多柔比星，是目前公认的能够较好模拟人类 AKI 的模型之一，其致病机制主要包括 3 个方面。 ① 阿霉素的细胞毒素的释放: 阿霉素作用于肾脏时产生的细胞毒作用较强，细胞毒在肾脏细胞中释放，导致足细胞形态改变、足细胞标志物裂隙素分布发生变动、细胞骨架结构异常。 ② 阿霉素导致脂质过氧化: 阿霉素中含有醌式结构，醌式结构产生的活性氧会使肾脏细胞发生脂质过氧化，破坏肾小球滤膜的完整性，大量蛋白漏出，产生蛋白尿。 ③ 阿霉素导致炎症发生: 阿霉素可刺激多种细胞因子及炎性介质活性增加，肾小球系膜细胞发生病变，其数量及基质增多，病程逐渐发展，最终形成肾小球硬化。 结合了国内外研究中的多种造模方式，改变阿霉素尾静脉注射的给药剂量和次数，最终确定造模的最佳条件为间隔1周2次重复注射阿霉素，分次给药累加剂量为7．5mg/kg时，模型效果最佳。据观察，此种给药方式可以通过减少阿霉素剂量，减少其他脏器负担，并且可以保证大鼠持续受到低剂量阿霉素刺激，肾毒性加重。 这种建模方法既降低了模型动物的死亡率，又可使模型状态稳定，对长期的试验研究有很大帮助。 2、顺铂致小鼠及非啮齿动物 AKI 模型 在目前的研究中，顺铂导致的肾损伤机制主要有炎性损伤、氧化应激、坏死及凋亡、自噬等多种途径。 此种方法为推荐造模方式，但经机体代谢产生的铂离子如何在肾脏组织中发挥作用仍然需要进一步研究。大鼠、小鼠等啮齿动物与人类在遗传学、体型、行为、寿命等方面存在明显差异，在啮齿动物身上建立的疾病模型有时不能很好地模拟人类疾病的过程; 但非啮齿动物，如迷你猪，在遗传学、机体构造和生理学方面均与人类相似，所以从动物模型建立的角度来看，迷你猪比啮齿动物模型更具优势。 研究表明应用顺铂诱导迷你猪AKI建模，单次静脉注射 3．8mg/kg顺铂，4 d 后便出现明显 AKI 特征。 此种方式建模速度快、可行性高，也进一步验证了顺铂作用于非啮齿动物建模的可行性。 3、脂多糖致大鼠、小鼠 AKI 模型 脂多糖为革兰阴性菌内毒素的主要成分，当革兰阴性细菌刺激机体发生免疫反应、导致机体损伤时，脂多糖是重要致病因素之一。脂多糖进入机体后可产生脓毒血症，脓毒血症会引起肾脏发生急性损伤，同时导致全身多器官衰竭，这也是脓毒血症发病中常见的致死原因。 机体感染革兰阴性菌时产生多种炎症因子，如白细胞介素-1、白细胞介素-6 和肿瘤坏死因子-α等，产生过多或活性增加均可导致肾脏损伤，肾功能发生改变，最后在一系列的病理生理学反应后，导致 AKI。脂多糖既能直接造成肾损伤，也可以间接的破坏肾脏细胞，最终导致肾脏细胞坏死，在AKI 的发展中起到重要作用。 发病机制分别为肾小管上皮细胞线粒体功能受损、氧化应激、炎症反应以及肾脏微循环障碍等。 比较了脂多糖、甘油、顺铂、阿霉素四种药物诱导 AKI 的区别。研究表明，在脂多糖诱导的 AKI 肾组织中，可见肾间质充血及炎性细胞增多，肾小管在不同程度上受损，上皮细胞由于坏死产生脱落，但没有甘油和庆大霉素所致肾小管损伤明显。 4、甘油致大鼠 AKI 模型 甘油是一种高渗性物质，使用甘油进行肌肉注射后，机体会因局部肌肉坏死以及局部红细胞溶解，造成横纹肌溶解( rhabdomyolysis，ＲM) 。肌红蛋白和血红蛋白属于小分子量物质，会比其他物质更容易通过肾小球进入肾小管，对肾小管造成破坏，最终导致急性肾小管坏死。 研究表明通过肌内注射 50% 甘油( 10 mL/kg) 建立ＲM致AKI大鼠模型，当甘油对其诱导 24 h 时后，肾脏组织学发生的变化最为明显，具体表现为双肾明显变大，肾脏表面有出血点，肾小管上皮细胞发生不同程度的脱落，甚至出现凋亡及坏死现象，脱落的上皮细胞在近曲小管和远曲小管附近聚集，伴有大量蛋白管型。 使用甘油进行动物建模是研究ＲM 所致 AKI 发病机制的一种比较成熟的方法。该模型的特点是肌红蛋白释放增多、肾小管梗阻和肾血管狭窄。最常见的给药方法是肌肉注射。 在疾病动物模型的研究中，应明确研究目的，结合适用性和实用性两个方面进行考虑，谨慎选择相应模型 |
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