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动物造模 | 非酒精性脂肪肝小鼠模型构建
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非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是一种严重危害人类健康的慢性代谢性疾病。据流行病学研究表明，目前全球已有超过25％的成年人患有 NAFLD。近年来，随着人们生活方式和饮食习惯的改变，肥胖和2型糖尿病的发生率随之升高，二者与 NAFLD 发生密切相关。NAFLD的发病率呈持续增高趋势，成为许多国家和地区常见的慢性肝脏疾病之一。 NAFLD 是出现于非嗜酒的患者一种综合征，其主要特点表现为肝细胞内脂肪过度堆积，导致肝细胞大泡性脂肪性变，带来一系列恶化，包括脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化，甚至死亡的发生等。NAFLD是由单纯的肝脂肪性变性(NAFL)发展为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，严重时可发展为肝纤维化，肝硬化，甚至肝细胞癌的连续疾病谱。目前, 对NAFLD的治疗仍是一个全球性的严峻课题，由于其病因和发病机制复杂，仍未完全阐明。而 NAFLD 的发病机制的研究与治疗药物的筛选，在很大程度上依赖于人类 NAFLD 病理机制相似模型的建立和应用。 营养失调性脂肪肝模型 高脂饮食(HFD)模型 高脂饮食模型是一种常见扰乱脂质代谢，导致脂肪肝变性，诱导 NAFLD 发生的造模方法。 高脂饮食通常选用含有60％脂肪的高脂饲料，C5７BL/６小鼠，由于对高脂饲料比较敏感，容易形成高脂血症，故而是常用的复制 NASH 模型的动物。C5７BL/６小鼠用高脂饮食喂养10-12w 后,出现高脂血症、高胰岛素血症和葡萄糖耐量异常的变化。 长期喂养高脂饮食34-36w 后，有研究者观察到小鼠血浆肝酶水平异常，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)水平升高。长期喂养80w后，出现典型的脂肪变性、肝细胞损伤、肝小叶炎症和纤维化。 与其他小鼠模型不同，喂食高脂饮食的小鼠模型模拟了人类 NAFLD 的组织病理学和发病机制，因为它具有 NAFLD 患者中观察到的主要特征，包括肥胖和胰岛素抵抗。因此，该模型适于评估减重、低脂饮食及改善胰岛素抵抗的治疗药物。高脂饮食模型也有一定的局限性，如造模耗时较长(通常需要12-16w)，而且随着动物种系和饮食配方的不同呈现出多样性。 致动脉粥样硬化饮食(ATH)模型 ATH 含有0.5％胆酸盐和1.25％的胆固醇，通常应用于小鼠以构建粥样硬化斑块模型。 有研究人员发现，ATH 可致C57BL/6小鼠出现血脂异常。与此同时，在６-24 w内，ATH 还引发了 NASH,且造模时间越长，病理状态越严重，如出现肝细胞大泡性脂肪性变，炎症以及肝纤维化等。此外，小鼠在６w 后也表现出丙氨酸氨基转移酶、总胆固醇和甘油三酯水平升高。然而，ATH 并不致体重增加，也没有明显的胰岛素抵抗现象，因此，与人类 NASH 病理机制有一定区别，成为该模型的缺陷。 高脂＋致动脉粥样硬化饮食(HFD＋ATH)模型 HFD＋ATH 是在高脂饮食的基础上，添加0.5％的胆酸盐和1.25％的胆固醇。该模型结合了高脂模型及 ATH 模型的优点，可有效地促进非酒精性脂肪肝炎的进一步发展，主要病理特征为胰岛素抵抗、氧化应激、肝星状细胞激活。 有研究者将 HFD＋ATH (60％脂肪＋1.25％胆固醇＋0.5％胆酸盐)与胆碱-蛋氨酸缺乏饮食进行分析比较，两者具有类似的 NASH 病理特征，HFD＋ATH 诱导的C57BL/6小鼠表现出肝胆固醇和游离脂肪酸增加，而胆碱-蛋氨酸缺乏饮食的小鼠为肝脏的甘油三酯水平升高为主。 高脂＋胆固醇饮食模型 高脂＋胆固醇饮食是在高脂饮食的基础上添加 21％的黄油和0.2％的胆固醇。短期喂养高脂＋胆固醇饮食后,C57BL/６J小鼠仅发生肝脏脂肪变性。而雌性 ldlr ˉ/ˉ 和 APOE２ki 小鼠会表现出严重的炎症和脂肪变性，其特征为巨噬细胞浸润和 NF-kappaB 介导的信号增强。有趣的是，雄性 ldlrˉ/ˉ和 APOE２ki 小鼠也出现严重的肝脏炎症，但未有脂肪变性。 高脂＋高糖饮食(ALIOS)模型 ALIOS 是一种高脂与高糖饮食协同诱导的小鼠模型，ALIOS 造模方法是高脂饲料(含30％的反式脂肪酸)及果葡糖浆喂养，16w后，C57BL/6小鼠有明显的脂肪变性，伴有坏死性炎症，丙氨酸转氨酶水平升高。与仅高脂饲料(含30％的反式脂肪酸)喂养相比，ALIOS 组动物体重明显增加，食物摄入量增加，胰岛素抵抗增强，但脂肪变性程度和丙氨酸转氨酶水平几乎无变化。 药物毒性诱导脂肪肝模型 链脲佐菌素(STZ)诱导模型 链脲佐菌素诱导模型常见于诱导2型糖尿病的实验性模型，C57BL/６小鼠在出生２d后，给予200μg/ L 剂量，并结合高脂饮食喂养，大约20w 内出现脂肪性肝炎、纤维化甚至肝癌，可以作为 NAFLD 的小鼠模型。有研究者诱导模型小鼠6周龄出现单纯性肝脏脂肪变性，８w时出现小叶炎症和肝细胞广泛气球样变，8-12 w 时肝脏脂肪沉积向纤维化发展，20w 时小鼠高发肝细胞癌。造模期间，小鼠的转氨酶和血糖浓度一直呈现升高趋势。该模型可以诱发氧化应激、炎症、纤维化和肝细胞凋亡，符合 NAFLD 的组织病理学。但与人类 NAFLD 的胰岛素抵抗不同的是，链脲佐菌素会破坏胰岛β细胞功能，而不会导致全身性的胰岛素抵抗。因此，这也限制该模型在临床前药物研究中的使用。 四氯化碳(CCl４)诱导模型 CCl₄是最早采用的试验性脂肪肝模型诱导剂，可以诱导肝纤维化小鼠模型。CCl₄诱导肝脏发生氧化应激反应，导致有毒脂质和蛋白质过氧化产物的积累，并发生严重的坏死反应。小鼠进行两周一次，腹腔注射CCl₄会造成广泛性肝损伤，肝细胞变性坏死，单核细胞轻度浸润以及大、小泡混合性肝脏脂肪变性等特征。此外，转氨酶和甘油三酯的水平也明显高于正常对照组。CCl₄单独诱导模型仅出现肝纤维化，而不发生肥胖和胰岛素抵抗等病变，因此不属于 NAFLD 模型。因此，CCl₄通常需要与饮食诱导模型相结合制备NASH模型，如 CCl₄可以促进高脂饮食对非酒精性脂肪肝炎和肝纤维化的发展。 NAFLD作为当前研究的热门领域，亟需深入研究其发病机制，评估相关药物疗效及寻找潜在的治疗靶标，NAFLD小鼠模型贯穿研究全程，在抗 NAFLD 领域中扮演不可或缺的角色。近年来，随着 NAFLD 领域大量的候选药物相继进入临床研究，一系列的 NAFLD 小鼠模型也相继被报道。不同致病因素所致 NAFLD 小鼠模型的形成机制及病理改变各异，各有其优点和缺陷，研究者需按照研究的目标选择适合的小鼠模型。随着 NAFLD 小鼠模型被不断优化，也为今后的 NAFLD 研究奠定了良好的实验物质基础，此外，构建能更好地模拟人类 NAFLD 病理特征的小鼠模型是近年来该领域的热点研究方向，优化为更理想的、能模仿 NAFLD 疾病谱的小鼠模型仍是今后亟待解决的关键问题。 |
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