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不依赖连接反应的克隆方法 LIC
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【关键词】 ,白细胞介素 Prokaryotic expression, purification and activity analysis of recombinant human interleukin29 LI MingCai, HE ShaoHeng Allergy and Inflammation Research Institute, Medical College, Shantou University, Shantou 515041, China 【Abstract】 AIM: To express recombinant human interleukin29 (IL29) with biological activity in E. coli. METHODS: The cDNA fragment coding for mature IL29 protein was amplified by PCR and cloned into vector pET44 Ek/LIC to construct fusion expression vector pET44 Ek/LICIL29. After pET44 Ek/LICIL29 was transformed into E.coli BL21(DE3), the bacteria were induced by IPTG. The expressed IL29 fusion protein was purified by NiNTA affinity chromatography and the fusion tag was removed from IL29 fusion protein by cleavage with enterokinase. The purified IL29 was subjected to Nterminal sequencing. The antiviral activity of IL29 was detected by cytopathic effect reduction assay. RESULTS: The DNA sequencing showed that the expression vector pET44 Ek/LICIL29 was constructed successfully. After induced by IPTG, the target protein accounted for 43% of the total bacterial protein and most was expressed in a soluble form in E. coli cultured at 30℃. The purified IL29 appeared a single band on SDSPAGE and its purity was more than 96%. The first 10 amino acid sequence of the Nterminus was consistent with the theoretical sequence. The recombinant IL29 showed specific antiviral activity that was comparable to the commercially available IFNα2b preparation. CONCLUSION: The recombinant human IL29 with biological activity has been obtained. 【Keywords】 interleukin29; Escherichia coli; soluble protein; purification 【摘要】 目的：在大肠杆菌中表达具有活性的重组人白细胞介素29(IL29). 方法：用PCR技术扩增人IL29成熟蛋白的编码序列，克隆入原核表达载体pET44 Ek/LIC中，构建融合表达载体pET44 Ek/LICIL29，转化大肠杆菌BL21(DE3)，以IPTG诱导表达IL29融合蛋白，经镍柱亲和层析纯化，然后用肠激酶消化除去N端融合标签得到完全天然状态的重组人IL29，经N端氨基酸测序鉴定纯化的IL29，用细胞病变抑制法测定其活性. 结果：成功构建了表达载体pET44 Ek/LICIL29，DNA序列测定结果与预期结果一致. 在30℃培养条件下，IPTG诱导表达的IL29融合蛋白占菌体蛋白总量43%左右，并且大部分以可溶形式存在. 纯化后的融合蛋白经肠激酶切割和回收后，所得目的蛋白(IL29)纯度大于96%，该蛋白N端序列与理论值一致，其抗病毒活性与IFNα2b相当. 结论：获得了具有生物学活性的重组人IL29. 【关键词】 白细胞介素29；大肠杆菌；可溶性蛋白质；纯化 人白细胞介素29(interleukin29, IL29)是2003年初发现的细胞因子［1］，它属于IL28家族的成员. 人外周血单核细胞(PBMC)和树突状细胞(DC)等在病毒感染［1-2］或poly I∶C［3-4］或脂多糖(LPS)［5］刺激下可产生IL29. 尽管IL28家族的基因结构与IL10相似，但其蛋白质结构与干扰素(IFN)更相近，所以也分别被称为IFNλ1(IL29), IFNλ2(IL28A) 和IFNλ3(IL28B)［2］. 近两年来的研究发现，IL29具有保护细胞抗病毒感染［1,2,6-8］、抑制几种细胞增殖［7-8］、上调MHC I抗原表达［1-2］和诱导DC成熟［3］等作用，在抗病毒感染和抗肿瘤等方面具有潜在的应用前景. 我们在克隆全长人IL29 cDNA的基础上［9］，构建了重组人IL29的原核表达载体，在大肠杆菌中进行表达、纯化并测定其抗病毒活性，为下一步深入研究及临床应用打下基础. 1材料和方法 1.1材料含全长人IL29编码序列的质粒pcDNA3.1/V5HisTOPOIL29由本室构建［10］；各种限制性内切酶购自美国New England Biolabs公司；Hotstar Taq DNA聚合酶、胶回收试剂盒(QIAquick Gel Extraction kit)购自美国Qiagen公司；pET44 Ek/LIC vector载体,E.coli NovaBlue, BL21(DE3), NiNTA HisBind树脂,肠激酶切割清除试剂盒(Enterokinase cleavage capture kit)均购自美国Novagen公司；蛋白质分子量标准及所有SDSPAGE相关材料购自美国BioRad；超滤管和蛋白质浓度测定试剂盒(Coomassie plus protein assay kit)购自美国Pierce；重组人IFNα2b(IntronA)购自爱尔兰ScheringPlough公司；溶菌酶和大部分其它化学试剂购自美国Sigma公司; 水泡性口炎病毒(VSV)和人羊膜细胞(WISH)为中国预防医学科学院病毒所提供. 1.2方法 1.2.1表达载体的构建以质粒pcDNA3.1/V5HisTOPOIL29［9］为模板设计PCR引物，序列如下：正向引物(P1)：5′GACGACGACAAGATCCCCACTTCCAAGCCCAC3′；反向引物(P2)：5′GAGGAGAAGCCCGGTTTAGGTGGACTCAGGGTGGG TTG3′. 其正向和反向引物的5′端均加入不依赖连接反应克隆(LIC)序列(下划线部分)，反向引物的斜体部分为终止密码子. 通过PCR扩增人IL29成熟蛋白编码序列，反应条件：95℃ 15 min热启动预变性，94℃ 40 s，65℃ 30 s，72℃ 40 s，共30个循环，最后72℃ 10 min. PCR产物用LIC特异的T4 DNA多聚酶处理后，连接到带LIC接头的pET44 Ek/LIC线性载体中，构建重组质粒pET44 Ek/LICIL29，转化感受态E. coli NovaBlue，氨苄青霉素(Amp)平板筛选阳性克隆，经菌落PCR和酶切鉴定并测序. 1.2.2工程菌的诱导表达将质粒pET44 Ek/LICIL29转化感受态E.coli BL21(DE3)即为工程菌， 在含Amp的LB平板上37℃培养过夜. 从转化平板上挑取单菌落，接种于含100 mg/L Amp的M9ZB培养基中，37℃振荡培养过夜，将培养物1∶40稀释于含Amp的LB培养基中，置37℃振荡培养大约3 h至A600 nm为0.6～0.8，加入1 mmol/L IPTG诱导表达. 对诱导温度和诱导时间等表达条件进行优化. 表达后离心收集表达菌，冰浴超声破碎细胞，离心，将菌体、破碎上清及破碎沉淀分别制成电泳样品并进行SDSPAGE电泳分析，以确定表达产物的溶解性. 1.2.3重组蛋白的纯化取培养过夜的工程菌1∶40稀释于含Amp的LB培养基中，置37℃振荡培养大约3 h至A600 nm为0.6～0.8，加入1 mmol/L IPTG，30℃诱导表达5 h后离心收集细菌，悬浮后于冰浴中进行超声处理，将裂解物离心，收集上清，然后按NiNTA HisBind Resin说明书操作，对可溶性表达蛋白进行纯化. 对洗脱液用超滤管进行脱盐和浓缩. 按肠激酶切割清除试剂盒说明书操作，对纯化的融合蛋白进行肠激酶消化和清除残余的肠激酶. 将样品再过一次NiNTA HisBind亲和柱，收集流过液即得到完全天然状态的IL29. 样品进行SDSPAGE分析. 凝胶图像分析系统分析蛋白纯度. 用考马斯亮蓝蛋白质浓度测定试剂盒测定蛋白含量. 对纯化后IL29进行N末端氨基酸测序和活性测定. 1.2.4IL29的体外抗病毒活性测定细胞病变抑制法，按文献［10］的方法进行. 2结果 2.1表达载体的构建以pcDNA3.1/V5HisTOPOIL29为模板，经PCR扩增获得编码人IL29成熟蛋白的DNA序列，大小为534 bp，编码178个氨基酸. 用不依赖连接反应的克隆方法(LIC)将扩增的序列插入pET44 Ek/LIC载体，构建重组表达载体pET44 Ek/LICIL29(图1). 挑取阳性克隆，经菌落PCR、酶切鉴定和DNA序列测定，结果均与预期设想一致，表明该载体构建成功. 2.2融合蛋白的诱导表达工程菌经1 mmol/L IPTG在30℃诱导不同的时间后，进行SDSPAGE，发现与未诱导的对照菌相比，诱导菌在Mr为77 000左右处有明显的表达带，其Mr与融合蛋白的理论计算值一致(图2). 随着诱导时间的延长，表达水平逐渐提高，但诱导4 h后表达水平不再提高，经凝胶图像分析系统分析表明，融合蛋白占菌体蛋白总量的43%左右，并且多数以可溶性蛋白形式存在(图3). 2.3重组蛋白的纯化在30℃培养条件下，诱导表达的IL29融合蛋白主要以可溶形式存在(图3). 可溶性表达产物经NiNTA亲和层析纯化后，获得了高纯度重组IL29融合蛋白. 纯化的IL29融合蛋白经肠激酶消化和回收后，得到完全天然状态的IL29(其Mr约为20 000)，样品进行SDSPAGE后，经凝胶图像分析系统分析显示，目的蛋白(IL29)的纯度超过96%(图3). 利用Applied Biosystems公司的492蛋白序列仪，采用Edman降解法，对纯化的重组人IL29蛋白的N端10个氨基酸进行序列测定，结果为PTSKPTTTGK，与人IL29成熟蛋白基因编码的序列一致. 2.4IL29的活性鉴定用细胞病变抑制法测定纯化产物的抗病毒活性，重组IL29抑制VSV感染引起的50% WISH细胞病变的需要量为0.88 μg/L，而阳性对照IFNα2b的为0.58 μg/L. 说明该重组IL29具有生物学活性，其活性比IFNα2b的略低. 3讨论 大肠杆菌遗传图谱明确，具有生长快速、安全性好、可进行高密度培养和适合表达不同基因产物等特点，已成为表达许多外源蛋白质的首选系统. 大量的有价值的基因产物在大肠杆菌中获得了表达［11-12］. 但是，在E.coli中表达的外源蛋白一般以不溶的包涵体形式存在. 在目的蛋白中融合可溶性的蛋白标签和降低重组菌的生长温度是减少包涵体形成的最常用方法. 我们所用的pET44 Ek/LIC载体整合了一个促溶解多肽NusA标签序列，保证了IL29融合蛋白能在大肠杆菌以可溶性形式表达. 同时，用pET44 Ek/LIC载体作表达还有很多优点：首先是它由T7强启动子控制，充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白，诱导表达几小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上；表达的蛋白还融合有多聚组氨酸和S蛋白标签，有利于目的蛋白的纯化和检测；在融合标签和目的蛋白之间有肠激酶和凝血酶切割位点，利用它们可以切除所有融合的标签蛋白；构建载体时采用不需要连接反应的克隆方法(LIC)，这种方法快速高效，而且为定向克隆. 较低的生长温度由于降低了蛋白质的合成速度和无活性聚集体形成的速率使细胞内易于形成聚集的折叠中间产物浓度降至最低，因此低温有利于蛋白产物的正确折叠，可以减少包涵体的形成，从而可以得到大量特异性的可溶蛋白. 我们在利用pET44 Ek/LICIL29诱导表达重组IL29时，发现降低温度可以增加重组IL29蛋白可溶性表达，在30℃下诱导表达时，重组IL29蛋白主要以可溶性形式存在. IL29融合蛋白中的多聚组氨酸和S蛋白标签的存在，可以用镍柱亲和层析或S蛋白亲和层析纯化，我们用NiNTA亲和层析一步法纯化，所获IL29融合蛋白的纯度很高. 纯化的IL29融合蛋白经肠激酶消化，可以切除所有的融合标签，经回收后，得到了纯度大于96%的重组IL29，N末端氨基酸测序证明了重组蛋白的正确性，同时，该蛋白具有抗病毒活性，说明我们制备重组IL29的方法是成功的. 本研究获得的高纯度重组IL29为进一步进行其理论研究和临床应用奠定了基础. 【参考文献】 ［1］ Sheppard P, Kindsvogel W, Xu W, et al. IL28, IL29 and their class II cytokine receptor IL28R［J］. Nat Immunol, 2003, 4(1): 63-68. ［2］ Kotenko SV, Gallagher G, Baurin VV, et al. IFNλs mediate antiviral protection through a distinct class II cytokine receptor complex［J］. Nat Immunol, 2003, 4(1): 69-77. ［3］ Coccia EM, Severa M, Giacomini E, et al. Viral infection and Tolllike receptor agonists induce a differential expression of type I and λ interferon as in human plasmacytoid and monocytederived dendritic cells［J］. Eur J Immunol, 2004, 34(3): 796-805. ［4］ Gautier G, Humbert M, Deauvieau F, et al. A type I interferon autocrineparacrine loop is involved in Tolllike receptorinduced interleukin12p70 secretion by dendritic cells［J］. J Exp Med, 2005, 201(9): 1435-1446. ［5］ Siren J, Pirhonen J, Julkunen I, et al. IFNalpha regulates TLRdependent gene expression of IFNalpha, IFNbeta, IL28, and IL29［J］. J Immunol, 2005, 174(4): 1932-1937. ［6］ Brand S, Zitzmann K, Dambacher J, et al. SOCS1 inhibits expression of the antiviral proteins 2′,5′OAS and MxA induced by the novel interferonlambdas IL28A and IL29［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2005, 331(2): 543-548. ［7］ Meager A, Visvalingam K, Dilger P, et al. Biological activity of interleukins28 and 29: Comparison with type I interferons［J］. Cytokine, 2005, 31(2): 109-118. ［8］ Dumoutier L, Tounsi A, Michiels T, et al. Role of the interleukin (IL)28 receptor tyrosine residues for antiviral and antiproliferative activity of IL29/interferonlambda 1: Similarities with type I interferon signaling［J］. J Biol Chem, 2004, 279(31): 32269-32274. ［9］ 李明才, 何韶衡. 人白细胞介素(IL)28和IL29基因的克隆与序列分析［J］. 细胞与分子免疫学杂志, 2004, 20(5): 635-637. ［10］ 中国生物作品标准化委员会编. 中国生物作品规程［M］. 北京: 化学工业出版社, 2000: 672-676. ［11］ 李岩, 黄勇, 陈南春, 等. 重组人血小板因子4的表达、纯化及活性鉴定［J］. 第四军医大学学报, 2005, 26(10): 888-891. ［12］ Swartz JR. Advances in Escherichia coli production of therapeutic proteins［J］. Curr Opin Biotechnol, 2001, 12(2): 195-201. （汕头大学医学院变态反应学与炎症学研究所，广东 汕头 515041） 编辑袁天峰 |
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