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动物造模 | 新西兰兔骨缺损动物模型
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动物造模 | 新西兰兔骨缺损动物模型 由创伤、肿瘤等疾病引起的大段骨缺损，仍是现今骨科领域的挑战。自体骨移植被认为是治疗骨缺损的“金标准”，但其供量有限，术中取骨需额外手术，术后可能造成取骨部位慢性疼痛、骨折、神经损伤及切口感染等并发症，限制了其临床应用；同种异体骨具有诱发免疫反应，与宿主骨整合、重塑缓慢，传播疾病等风险。以多孔性生物相容的支架材料为基础的组织工程方法为骨缺损的临床治疗提供了一种有潜力的治疗途径，为获得骨组织工程材料的特性，需要建立合适的骨缺损动物模型。 动物的选择 常用的大型动物有羊、犬、猪，小型动物有鼠、兔等。 虽然鼠类实验成本较低，但体型较小，手术操作复杂，对实验者要求较高；其次，作为小型啮齿动物，鼠类骨结构较原始，缺乏哈弗系统，其骨损伤后修复机制可能与人体修复机制不同。而兔、犬、猪等动物具有与人体相似的骨骼哈弗系统，骨架大小合适，手术操作难度低，是比较理想的实验动物。犬和猪实验成本较高，不适合推广应用，因而兔是比较常用的骨缺损模型动物。其中新西兰白兔因其骨骼成熟时间短，廉价且易于饲养和处理，抗病能力较强，能够进行符合足够统计条件的研究等特点，成为世界上肌肉骨骼系统研究中使用最为广泛的实验兔品种。 兔龄的选择 新西兰兔年龄阶段分为：仔兔：0~1个月；幼兔：1~3个月；中期兔（青春期）：3~8个月；成年兔：8个月~3岁；老年兔：3岁以上。 现有文献报道中兔龄差距较大，有选择4月龄至12月龄不等，实验一般选择骨成熟的兔，可参考兔龄和影像检查。4月龄新西兰兔骨骼已生长至其长骨长度的95%，且在5~8个月龄时停止；有学者认为幼年兔的缺损较容易修复，建议实验选择大于6个月的兔。同样的，有研究者认为8个月龄兔骨骼生长基本发育成熟，可选择8个月龄兔代表成年兔进行骨缺损模型的制备；有研究者为保证兔子骨骼成熟，只纳入6个月及6月以上的兔，并通过X线观察骨的发育情况来挑选需要的兔。此外，有研究者发现6个月龄或更大的兔，其扭转力学特性渐渐趋于平稳。 综上所述，可选择6个月或>6个月龄的兔作为骨缺损动物模型。如实验有需要，兔龄结合影像检查的方法同样适用选择出幼龄兔或老年兔进行相关年龄阶段的骨缺损修复实验。 常见造模方法 实验中常用的兔骨缺损部位主要有桡骨干、股骨干及股骨髁等处，每一种模型中骨缺损大小及建模过程亦不相同。 01 兔桡骨干模型 造模方法：实验动物在自然情况下不能自行愈合的最小尺寸的骨缺损即临界骨缺损或称骨极限缺损 （critical sizedefect, CSD）。有研究者对不同长度桡骨缺损做了分组对比：他们选取18只6月龄雄性新西兰兔，随机分为10、15、20 mm三组。术后12周肉眼可见10 mm组断端完全桥接且塑性良好，15 mm组仅有3例断端桥接，而20mm组断端未愈合；同时CT观察标本发现10 mm组髓腔再通，断端桥接，15 mm及20 mm组仅见少量骨再生，Hedberg评分显示：15 mm组修复能力与10 mm组有统计学差异，而与20 mm组无差异。基于上述结果，他们认为 6 月龄雄性新西兰兔制作桡骨CSD模型的长度选择15 mm较为合适。 优点：兔桡骨干骨缺损模型还具有手术操作简单、术中出血少等优势。 缺点：该模型无法避免桡、尺骨间相互影响，桡骨骨缺损所产生的病理改变和生物力学变化可被另一骨的完整性部分代偿,同时还存在着成骨量少、与实际修复骨缺损环境差距较大等缺陷。 02 兔股骨干模型 造模方法：有研究者选取18只4~5 月龄成年新西兰兔，随机分为三组，分别制作10、15、20 mm长度的股骨干骨缺损，并以接骨板螺钉固定缺损两端。术后8、12周肉眼观察到10 mm组断端骨痂桥接，达到骨愈合，而15、20 mm骨缺损组断端处无连续骨痂通过，仍被纤维瘢痕组织填充。通过X线进一步证实10 mm骨缺损组第8、12周时骨缺损区有明显的新生骨痂影形成，而15、20mm骨缺损组在各时间点缺损区均无成骨。 最后组织学进一步证明12周时10 mm缺损组缺损区被大量新生骨和软骨组织填充，部分髓腔再通，近皮质处可见成熟的板层骨组织，而15、20 mm骨缺损组在12周缺损处仍由纤维结缔组织填充，无骨组织生成。他们认为经接骨板螺钉固定的15 mm兔股骨干模型可作为负重骨骨缺损模型。 优点：兔股骨为后肢单一负重骨，可以避免临近骨的代偿性作用对实验的影响；另一方面，临床上常见的骨缺损、骨不连常发生在股骨、肱骨等单一负重骨的骨干。可将兔股骨干骨缺损模型作为单一负重长骨缺损的动物模型。 缺点：兔股骨干骨缺损模型需要额外的固定，这些内固定装置占据骨缺损位置，且稳定性较差，可能会影响断端骨愈合，内固定物属于异物，长期存在于体内，增加了术后感染的风险，不方便术后管理，另外也会对植入物的实验作用产生干扰。在手术操作中，由于内外固定物的应用，相对于其他类型骨缺损模型，术中对局部软组织及骨膜造成的损伤也相对较大。 03 兔股骨髁模型 造模方法：有研究者利用成年新西兰兔制作直径6mm，深8mm股骨髁骨缺损模型，空白组术后30d组织学观察发现：3例样本有结缔组织长入缺损空腔，缺损骨边缘有骨吸收现象，2例发现编织骨长入缺损处，同时有软骨骨痂形成。术后90 d编织骨被更成熟板状骨替代 ，至术后 180 d有3例样本缺损处充满皮质骨。 考虑兔的解剖学特征，有学者认为可进一步加深缺损深度，选择直径6mm，深10mm圆柱形骨缺损模型。有研究者在实验中选用9月龄新西兰兔，设计左侧为实验组，右侧作为空白组。术后组织学观察：空白组没有发现明显新生骨，仅存在少量脂肪组织及血管。空白组在术后4个月X线仍能够清晰观察到缺损处存在孔隙，但孔隙随时间渐变小，与周围正常骨质相比，缺损处骨密度减低。他们认为这是由于缺损处骨表面仅部分愈合，没有被充分修复的结果。 优点：兔股骨较上肢骨明显粗大，股骨髁突起明显，在体表可触及，便于术中解剖定位，手术操作时对周围组织损伤较小。另外，股骨作为后肢单一负重骨，可避免邻近骨的影响，股骨髁骨缺损模型还具有不需要额外固定等优势。 骨膜的处理 由于骨膜能为骨缺损部位提供营养物质和具有成骨潜能的干细胞，参与骨的自我修复，因此在骨干骨缺损模型制备过程中，骨膜是否去除及剥离程度对CSD 值有一定的影响。 在截除一段骨干后对骨膜的处理主要有完全保留骨膜、切除与截骨等长的骨膜和在切除与截骨等长骨膜的基础上通过扩髓去除两断端骨内膜等，它们的修复能力依次降低，对应的临界缺损值也依次减小。在对负载骨骨形态发生蛋白 BMP-2、生长因子或成骨细胞的骨替代材料所进行的动物实验中，为避免植入后受周围组织所释放的生长因子、成骨细胞等自身修复因素的干扰，常用不可吸收膜采用包裹或隔离的方式，阻止血管长入及阻碍营养物质和生长因子等进入骨修复区域，以客观反映载体的成骨性能及其与未负载或负载不同生物成分的骨替代材料在修复能力上的差异。 模型的固定方式 骨缺损实验的固定方式主要有髓内针、钢板、外固定架、自制固定器等方式。髓内针固定需要移植材料中部有孔，多用于移植骨、医 用金属等具有中空结构的力学性能较好材料的实验；钢板内固定很常见，如需加强固定可增加钢丝或手术缝线在骨与钢板或植入材料之间进行捆扎，动物实验中因动物活动等在外固定固定的种类上只能采取单臂外固定器进行固定。 骨缺损实验的固定方式主要有髓内针、钢板、外固定架、自制固定器等方式。髓内针固定需要移植材料中部有孔，多用于移植骨、医用金属等具有中空结构的力学性能较好材料的实验；钢板内固定很常见，如需加强固定可增加钢丝或手术 缝线在骨与钢板或植入材料之间进行捆扎，动物实验中因动物活动等在外固定固定的种类上只能采取单臂外固定器进行固定。 总结 新西兰兔骨缺损动物模型的制作及设计需综合考虑: 根据实验经费、目的、骨缺损制备手术的难易度和不同模型的优缺点，选择合适的部位、缺损值； 合理调整缺损的次要影响因素，如年龄、体重、居住空间、骨膜剥离度等； 合理设置兔的数量，并通过影像学和组织学等检查方式，确认在实验结束后未移植材料的缺损不能自愈。 骨缺损动物模型的建立要考虑多方面因素。在实验设计时，应密切结合临床，根据不同部位骨缺损的生物力学特性及相关的治疗方式，选择合适的骨缺损动物模型。这样，才能设计出更能符合实验需要的骨缺损模型，为临床骨缺损的治疗提供更为可靠的动物实验。 |
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