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实验技能分享|载体构建及原核表达
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01实验目的 基因表达是生物学研究中的重要内容之一，而基因表达载体则是基因表达研究中不可或缺的工具。基因表达载体是一种能够将外源基因导入到细胞中并使其表达的DNA分子。在细胞内，基因表达载体可以通过转录和翻译的过程将外源基因转化为蛋白质，从而实现基因表达。 02实验原理 表达载体是用来在受体细胞中表达外源基因的载体，原核表达载体通常为质粒，表达载体除具有克隆载体所具有的性质以外，还应具有表达元件（转录和翻译所必须的DNA序列）。 大肠杆菌表达载体要求：①有一个强的启动子及其两侧的调控序列；②应有SD序列，且SD序列与起始密码子ATG之间要有合适的距离；③在克隆基因与启动子之间有正确的阅读框架；④外源基因下游应加入不依赖ρ因子的转录终止区。 构建好表达载体之后，提取重组载体的质粒，然后用质粒进行表达宿主菌的转化。 03实验步骤 1.目的片段的获取 1.1 引物设计 在NCBI上查找目的基因SD序列，使用Primer 5软件进行引物的设计，在设计引物时须引入合适的酶切位点和保护性碱基 感受态细胞（和转化Top10同理）； b.挑取单菌落接种至含抗性（与载体上抗性基因一致）的液体LB培养瓶中，置于摇床上37 ℃ 220 rpm培养过夜； c.将过夜培养的菌液以1:100的比例接种于含抗性（与载体上抗性基因一致）的液体LB培养瓶中扩大培养； d.待OD600=0.6-0.8时，取1mL菌液作为未诱导全菌样品对比，并向剩余菌液中加入终浓度为0.5 mM的IPTG，置于摇床上低温180 rpm诱导过夜。 3.3 超声破碎菌液 a.从过夜诱导后的菌液中取1mL作为诱导后全菌样品对比，收集剩余菌液离心（8000 rpm，20 min，4℃）弃上清用PBS重悬浓缩（浓缩比例约10:1）； b.超声破碎（超声4 s，停歇7 s）至透亮，结束后离心（10000 rpm，30min，4℃）分别收集上清和沉淀，将其作对照组取样； c.取诱导前全菌，诱导后全菌，诱导后上清，诱导后沉淀各40μL，加入10 μL 5×loading buffer，于99℃变性20min，进行SDS-PAGE电泳分析。 发自小木虫Android客户端 |
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