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lxlcici

木虫 (小有名气)

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[交流] 细胞培养

我不是药学专业的学生，但是最近在培养细胞，连续两次细胞都被污染了，损失惨重，都不好意思去见导师，自己也没有信心再去培养，大家有没有经验，告诉我应该注意什么？谢谢各位了！

[ Last edited by amisking on 2009-10-15 at 12:47 ]

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1楼 2009-10-15 11:22:08

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bigbangrex

铁杆木虫 (小有名气)

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★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
司马诸葛(金币+5,VIP+0):谢谢 10-15 14:44

我也是新手，这是些资料希望能帮你。
（一）培养前准备：在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。这样可以避免开始实验后，因器材不全往返拿取而增加污染机会。（二）操作区消毒：无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面一次(拖布要专用)，紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用70酒精擦洗，然后紫外线消毒30min。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线，消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线降低消毒效果。实验用品，如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用要用70%酒精擦拭后才能带入无菌操作台，同时紫外线消毒。
（三）洗手和着装：原则上和外科手术相同。平时仅做观察不做培养操作时，可穿装细胞培养室内紫外线照射30min的清洁工作服。在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用70%酒精消毒手。如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。（四）火焰消毒：在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作，如安装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处进行。但要注意：烧过的金属镊要待冷却后才能挟取组织，以免造成组织损伤；吸取过营养液后的吸管不能再用火焰烧灼，因残留在吸管头中营养液能烧焦形成炭膜，再用时会把有害物带入营养液中；开启、关闭长有细胞的培养瓶时，火焰灭菌时间要短，防止因温度过高烧死细胞；另外胶塞过火焰时也不能时间长，以免烧焦产生有毒气体，危害培养细胞。（五）操作：开启无菌操作台风机运转10分钟后，才可开始实验操作，动作要准确敏捷，但又不能太快，幅度不能太大，以防空气流动，增加污染机会。无菌操作工作区域应保持清洁与宽敞，必要物品，如试管架，移液器或吸管头等可以暂时放置，其它实验用品用完后应及时移出,以利气体流通。实验操作应在操作台中央无菌区域内进行，勿在边缘非无菌区域操作。不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。为拿取方便，工作台面上的用品要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。工作自始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处理之前，勿过早暴露在空气中。同样，培养液在未用前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口（敞开直立可增加落菌污染机会）。吸取营养液、PBS、细胞悬液及其它各种用液时，均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细胞交叉污染。工作中不能面向操作区讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方，不要在打开的容器正上方操作实验容器打开后，用手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放在台面上。瓶口最易污染，加液时如吸管、吸头尖碰到瓶口、瓶外，则应将吸管换掉。每次操作只处理一株细胞，以免造成细胞交叉污染。验结束后，将实验物品带出工作台，如需要继续进行下一个实验，则用70% 酒精擦拭无菌操作台面，再让无菌操作台风机运转10分钟后，才可进行下一个实验操作。（六）安全：工作人员应注意自身的安全，必须穿戴实验衣与手套后才进行实验。对于来自人源性或病毒感染的细胞株应特别小心,并选择适当等级的无菌操作台(至少两级)。操作过程中，应避免气溶胶的产生，小心有毒性试剂，例如DMSO（二甲基亚砜），并避免尖锐物品伤人等。