| 查看: 870 | 回复: 1 | |||
[交流]
细胞划痕，满满干货 已有1人参与
|
|
细胞划痕，满满干货 细胞划痕(wound healing）法是简捷测定细胞迁移运动和修复能力的方法。 一、原理 在体外培养皿或平板培养的单层贴壁细胞上，用微量枪头或其它硬物在细胞生长的中央区域划线，去除中央部分的细胞，然后继续培养细胞至实验设定的时间，取出细胞培养板，在显微镜下观察并拍照记录特定位置细胞的生长迁移能力。 通过不同分组之间的细胞对于划痕区修复能力的不同，可以判断各组细胞的迁移与修复能力的差别。 二、步骤 1、准备： 所有能灭菌的器械都要灭菌，直尺和 marker 笔在操作前紫外照射 30 min（超净台内） 2、流程： 1. 培养板划线：先用 marker 笔在 6 孔板背后，用直尺比着，均匀得划横线，大约每隔 0.5~1 cm 一道，横穿过孔，每孔至少穿过 5 条线； 2. 铺细胞：在孔中加入约 5×105 个细胞，具体数量因细胞不同而不同，掌握为过夜能铺满； 3. 细胞划线：第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜； 4. 洗细胞：用 PBS 洗细胞 3 次，去除划下的细胞，加入无血清培养基； 5. 细胞培养及观察：放入 37℃、5% CO2 培养箱，培养；按 0，6，12，24 小时取样，倒置显微镜观察特定位置细胞迁移情况并拍照； 6. 结果分析：使用 Image J 软件打开图片后，随机划取 6-8 条水平线，计算细胞间距离的均值。 三、注意事项 1、铺细胞最好使用 6 孔板，因为 6 孔板可以保证有相当距离的平直划痕，而且因为有 5 条定位线，与划痕相交，这样就有10 个可固定监测点，不作重复，误差也很小。 2、如果你连续监测 24 小时，你需要考虑到划痕缩小是细胞迁移和细胞繁殖共同作用的结果，而不是单纯的细胞迁移。 如果你要单纯的考虑细胞迁移，你可以先用丝裂霉素（1 ug/ml）处理一小时，抑制细胞的分裂，这样你的结果就是细胞迁移的作用了。另外，使用无血清培养基也可以降低增殖对实验结果的影响。 3、照片拍完之后，可以用 ImageJ 来测量划痕区域的像素定量比较细胞迁移的速度。 4、虽然无血清培养可以忽略细胞增殖的影响，但是由于细胞内信号传导系统整体性的下调节，细胞迁移的速度也会慢很多。 5、应尽量清洗掉散落的细胞，对于一些细胞，低血清浓度下也能重新贴壁并增殖，此外也影响数据美观。 四、常见问题 1.划痕法测量适用的细胞范围较小，一般只适用于上皮细胞，纤维样细胞。 2.虽然无血清培养可以忽略细胞增殖的影响，但是由于细胞内信号传导系统整体性的下调节，细胞迁移的速度也会慢很多。 3、在用 PBS 缓冲液冲洗时，注意贴壁慢慢加入，以免冲散单层贴壁细胞，影响实验拍照结果。 4、一般做划痕实验，需要排除细胞增殖的影响，一般在不影响细胞增殖的情况下采用低血清（<2%）或者无血清，否则细胞增殖就不能忽略，这样对于迁移较慢的细胞就需要延长拍摄时间（也可用丝裂酶处理一小时）。 5、按照 6 孔板背后画线的垂直方向划痕，可以形成若干交叉点，作为固定的检测点，以解决了前后观察时位置不固定的问题。 6、每次拍照前、后，尽量换掉培养基，去除飘落的细胞，能得到较为干净的划痕区域。 |
回复此楼» 猜你喜欢
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有233人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有18人回复
-
散金
已经有67人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
2楼2024-02-29 22:18:46
