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活体成像捕捉细胞一举一动，让肿瘤细胞无所遁形！
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活体成像捕捉细胞一举一动，让肿瘤细胞无所遁形！ 活体成像主要采用生物发光（bioluminescence）与荧光（fluorescence）两种技术。生物发光是用荧光素酶（Luciferase）基因标记细胞或DNA，而荧光技术则采用荧光报告基团（GFP、RFP、Cyt及dyes等）进行标记。采用一套非常灵敏的光学检测仪器，让研究人员能够直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为。通过这个系统，可以观测活体动物体内肿瘤的生长及转移、感染性疾病发展过程、特定基因的表达等生物学过程。传统的动物实验方法需要在不同的时间点宰杀实验动物以获得数据，得到多个时间点的实验结果。相比之下，可见光体内成像通过对同一组实验对象在不同时间点进行记录，跟踪同一观察目标（标记细胞及基因）的移动及变化，所得的数据更加真实可信。另外，这一技术对肿瘤微小转移灶的检测灵敏度极高，不涉及放射性物质和方法，非常安全。因其操作极其简单、所得结果直观、灵敏度高等特点，在刚刚发展起来的几年时间内，已广泛应用于生命科学、医学研究及药物开发等方面。 No.1实验过程 通过分子生物学克隆技术，应用单克隆细胞技术的筛选，将荧光素酶的基因稳定整合到预期观察的细胞的染色体内，培养出能稳定表达荧光素酶蛋白的细胞株。 典型的成像过程是：小鼠经过麻醉系统被麻醉后放入成像暗箱平台，软件控制平台的升降到一个合适的视野，自动开启照明灯拍摄第一次背景图。下一步，自动关闭照明灯，在没有外界光源的条件下拍摄由小鼠体内发出的光，即为生物发光成像。与第一次的背景图叠加后可以清楚的显示动物体内光源的位置，完成成像操作。之后，软件完成图像分析过程。使用者可以方便的选取感兴趣的区域进行测量和数据处理及保存工作。当选定需要测量的区域后，软件可以计算出此区域发出的光子数，获得实验数据。软件的数据处理和保存功能非常强大，可以加快实验速度，方便大批量的实验。 No.2技术应用 通过活体动物体内成像系统，可以观测到疾病或癌症的发展进程以及药物治疗所产生的反应，并可用于病毒学研究、构建转基因动物模型、siRNA研究、干细胞研究、蛋白质相互作用研究以及细胞体外检测等领域。具体应用如下： 01.标记细胞 (1)癌症与抗癌药物研究 直接快速地测量各种癌症模型中肿瘤的生长和转移，并可对癌症治疗中癌细胞的变化进行实时观测和评估。活体生物发光成像能够无创伤地定量检测小鼠整体的原位瘤、转移瘤及自发瘤。 (2)免疫学与干细胞研究 将荧光素酶标记的造血干细胞移植入脾及骨髓，可用于实时观测活体动物体内干细胞造血过程的早期事件及动力学变化。有研究表明，应用带有生物发光标记基因的小鼠淋巴细胞，检测放射及化学药物治疗的效果，寻找在肿瘤骨髓转移及抗肿瘤免疫治疗中复杂的细胞机制。应用可见光活体成像原理标记细胞，建立动物模型，可有效的针对同一组动物进行连续的观察，节约动物样品数，同时能更快捷地得到免疫系统中病原的转移途径及抗性蛋白表达的改变。 (3)细胞凋亡 当荧光素酶与抑制多肽以融合蛋白形式在哺乳动物细胞中表达，产生的融合蛋白无荧光素酶活性，细胞不能发光，而当细胞发生凋亡时，活化的caspase-3在特异识别位点切割去掉抑制蛋白，恢复荧光素酶活性，产生发光现象，由此可用于观察活体动物体内的细胞凋亡相关事件。 02.标记病毒 (1)病毒侵染 以荧光素酶基因标记的HSV-1病毒为例，可观察到HSV-1病毒对肝脏、肺、脾及淋巴结的侵和病毒从血液系统进入神经系统的过程。多种病毒，腺病毒，腺相关病毒，慢病毒，乙肝病毒等，已被荧光素酶标记，用于观察病毒对机体的侵染过程。 (2)基因治疗 基因治疗包括在体内将一个或多个感兴趣的基因及其产物安全而有效的传递到靶细胞。可应用荧光素酶基因作为报告基因用于载体的构建，观察目的基因是否能够在试验动物体内持续高效和组织特异性表达。这种非侵入方式具有容易准备、低毒性及轻微免疫反应的优点。荧光素酶基因也可以插入脂质体包裹的DNA分子中，用来观察脂质体为载体的DNA运输和基因治疗情况。 03.标记细菌 (1)细菌侵染研究 可以用标记好的革兰氏阳性和阴性细菌侵染活体动物，观测其在动物体内的繁殖部位、数量变化及对外界因素的反应。 (2)抗生素药物 利用标记好的细菌在动物体内对药物的反应，医药公司和研究机构可用这种成像技术进行药物筛选和临床前动物实验研究。 04.基因表达和蛋白质相互作用 (1)组织特异性基因表达 荧光素酶（luciferase）是一类生物发光酶，其中的renilla荧光素酶和firefly荧光素酶分别识别不同的底物，一种细胞可被这两种荧光素酶标记:renilla荧光素酶基因由一组成性稳定表达的启动子驱动，作为内参，反应细胞数量的变化;firefly荧光素酶基因由要研究的组织特异性启动子驱动。这样firefly荧光素酶发光信号的变化，在消除细胞数量变化的影响后就可反应特定的启动子在动物体内的表达活性。 (2)蛋白质相互作用 观察细胞中或活体动物体内两种蛋白质的相互作用，是将荧光素酶基因分成两段，分别连接所研究的两种蛋白之一的编码DNA，然后导入细胞或动物体内表达为融合蛋白。当两种蛋白有强相互作用时，表达的荧光素酶两部分相互靠近形成有活性的荧光素酶，在有底物存在时出现生物发光，反映出所研究的两种蛋白存在相互作用。应用此原理亦可用于研究细胞信号传导途径。 (3)阻断RNA 通过对比生物发光的变化，验证在成年小鼠体内，注射双链siRNA可以特异地阻遏基因表达。 05.转基因动物模型 (1)基因表达 为研究目的基因是在何时、何种刺激下表达，将荧光素酶基因插入目的基因启动子的下游，并稳定整合于实验动物染色体中，形成转基因动物模型。利用其表达产生的荧光素酶与底物作用产生生物发光，反应目的基因的表达情况，从而实现对目的基因的研究。可用于研究动物发育过程中特定基因的时空表达情况，观察药物诱导特定基因表达，以及其它生物学事件引起的相应基因表达或关闭。 (2)各种疾病模型 研究者根据研究目的，将靶基因、靶细胞、病毒及细菌进行荧光素酶标记，同时转入动物体内形成所需的疾病模型，包括肿瘤、免疫系统疾病、感染疾病等等。可提供靶基因在体内的实时表达和对候选药物的准确反应，还可以用来评估候选药物和其它化合物的毒性。为药物在疾病中的作用机制及效用提供研究方法。 |
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