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核糖核酸酶保护实验
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核糖核酸酶保护实验 核糖核酸酶保护实验（Ribonuclease protection assay，RPA）基本原理是将标记的特异RNA探针(32P或生物素)与待测的RNA样品液相杂交，标记的特异RNA探针按碱基互补的原则与目的基因特异性结合，形成双链RNA；未结合的单链RNA经RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸，而待测目的基因与特异RNA探针结合后形成双链RNA，免受RNA酶的消化。 对于32P标记的探针，杂交双链进行变性聚丙酰胺凝胶电泳，用放射自显影或磷屏成像系统检测被保护的探针的信号; 对于生物素标记的探针，杂交双链经过变性聚丙酰胺凝胶电泳后电转移至尼龙膜，采用链霉亲和素－辣根过氧化物酶（Streptavidin-HRP）和化学发光底物与膜上biotin标记的探针结合，X射线胶片或化学发光图像分析仪检测杂交信号。 与Northern杂交相比，核糖核酸酶保护实验灵敏度更高；由于没有PCR扩增的步骤、避免了PCR扩增造成的偏移，可以更准确的反应RNA的丰度；在一个反应体系中可以同时检测多个指标。 完整的RPA实验包括探针的制备/标记、杂交、RNaseA 消化、变性聚丙酰胺凝胶电泳和信号检测等步骤。具体操作如下： 一、探针的制备/标记 探针的制备一般使用体外转录的方法进行。 1.载体构建及PCR 构建含有探针序列的质粒。 设计含有T7或SP6启动子的PCR引物，注意：PCR产物是探针的模板，所以启动子序列在下游引物中。 2.体外转录 利用体外转录体系，以PCR产物为模板，合成探针。常用的体外转录体系如下： 4 ul 5倍转录缓冲液 2 ul 0.1 M DTT 4 ul 2.5 mM NTP（A，C，G） 0.8 ul RNA酶抑制剂（25 U/ μl）（Promega） 100 μM 标记UTP（32P） 1 ul RNA聚合酶SP6，T7或T3 总体积 20 ul。 孵育1小时，37℃。 二、杂交 1.探针纯化 可以使用QIAGEN公司的QIAquick核苷酸去除试剂盒或Boehringer离心柱（G50葡聚糖凝胶）进行。 2.杂交 RNA提取后溶于杂交缓冲液，调整浓度为1μg/μL，8μL RNA中加入2μL探针，95℃变性5分钟，40-55℃孵育4小时（孵育温度根据探针的溶解温度确定）。 3.消化 1)加入RNAse消化液，37℃保温30分钟。 2)加入10%的SDS10μL，蛋白酶K（10μg/μL）20μL，37℃保温10分钟。 3)苯酚-氯仿抽提，取上清。 4)异丙醇或无水乙醇沉淀RNA。 5)洗涤、溶解沉淀。 三、聚丙酰胺凝胶电泳 电泳方法同常规的SDS-PAGE电泳。 四、检测 放射自显影检测。 注：探针也可采用非放射性标记（如：生物素标记），那么随后的检测也需要按照非放射性标记的流程进行。 在一个反应体系中使用了6种探针，3种不同的实验方法进行实验，每一种方法重复3次（Tam Thuan Nguyen , Jeffrey B Smith.2002） |
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