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动物实验 | 四种脑出血动物造模方法的优劣盘点
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动物实验 | 四种脑出血动物造模方法的优劣盘点 脑出血（intracerebral hemorrhage，ICH）目前占全部脑卒中发病的10%～20%，依靠目前的循证医学方法，对其有用的治疗手段较少。ICH患者于30d内死亡的可能性高达35%～52%，且有80%的患者在出血后6个月时生活仍不能自理。ICH的致死致残率很高，且目前治疗中能提升患者生存率以及提高出血后生活质量的较少。因此，构建能够模拟疾病发生发展的动物模型极为重要。 动物的选择 大鼠、小鼠、兔、猴、狗、猪。其中，SD大鼠是目前最常用的脑出血实验动物，其优势是价格低廉、容易饲养，可以选取大样本实验，实验数据较可靠，且大鼠相对于大动物而言，形体较小，可控性强。人类脑出血的常见位置为尾状核，而大鼠的尾状核是脑内最大核团，较易观察大脑的生理病理变化，所以用大鼠制作脑出血模型能较好地模拟人类脑出血部位。 造模方法 目前开展科学研究的常用脑出血模型包括四种：胶原酶注射脑出血模型，自体血注入脑出血模型，微球囊充盈脑出血模型，高血压性脑出血模型。 一、脑出血模型 1、胶原酶注射脑出血模型 胶原酶分为多型，目前研究认为Ⅳ型和Ⅶ型用于脑出血建模最恰当。 造模方法：SD 大鼠麻醉消毒后固定，颅骨转孔，使用立体定位仪定位大鼠脑一侧尾状核，将微量注射器针头插入脑组织尾状核，分别分组注入0.5μL胶原酶，连续观察10 min后即可见发生出血，且出血后症状明显、持续时间较长。 优点：方法简单、快捷、成功率较高，出血稳定性好，并可多次重复；其能较好地模拟人体脑血管自发出血的生理生化过程以及出血后血肿持续扩大的病理变化过程。 缺点：胶原酶并不能造成血管的物理性破裂，实际上是造成了小血管的广泛慢性渗血，形成的血液渗出灶并不是真正意义上的局限的血肿，急性占位效应不明显，与人类脑出血的病理过程仍有区别。另外，胶原酶本身可造成脑组织严重的炎症反应，并且对血管有广泛的破坏作用，这些不良作用可对脑出血后单纯由血肿形成的炎症反应研究产生干扰。另外，胶原酶对脑组织有细胞毒性作用，可严重损伤神经功能及血脑屏障，因此并不能完全模拟人类单纯脑出血后二次损伤的病理生理状态，不能用来研究脑出血后血肿周围组织血液循环障碍，有一定的局限性。 应用：适用于评估脑出血后各类指标的长期观察。 2、自体血局部注入法 ① 单步注射法 该方法是抽取动物自身一定量血液通过定位技术注入该动物脑尾状核造成该部位血肿的一种建模方法，自体血尾状核注射脑出血模型是目前较为理想的脑出血模型。 造模方法：麻醉并固定动物后，动物颅骨局部转孔，取选定脑组织局部注射动物非肝素化自体血，注血量与动物脑组织大小相关（鼠脑注血量分别为25 μl、50 μl和100 μl，分别相当于人脑20 ml、40 ml和80 ml的出血量）。 但是自体血注入法存在注血过程中血液逆流现象，影响了血肿大小形成的稳定性。由于尾状核较为致密，注血时局部压力较高，而新鲜凝固的血块强度很低，很难抵抗血肿膨胀的压力，无法从根本上解决血液逆流的难题。 优点：由于造模方法操作简单，特别是应用立体定向仪后，动物的死亡率明显降低，且血肿位置更加精确，除有不可避免的穿刺针道损伤外无其他异体物质和杂质，故该模型的病理过程更接近人的自发性脑出血。 缺点：模型都不能呈现良好的可重复性，且造成的血肿体积不稳定，成功率较低，同时有出现脑室及硬膜下间隙之间破裂出血和注射的血液返流等情况。 ② 两步注射法 由于单步注射法存在较多的缺陷，现在常用的方法是两步注射法，提高了成功率的同时减少了血液的返流。 造模方法：先注射15 μL自体血，后静置针头7 min，使血凝块形成将针道封堵，再注射余下35 μL。 优点：除了一步注射法的优点外，还能有效地减少针道反流的血量，较好地控制了血肿的大小、形态及部位。并且可以观察血液凝固过程中局部脑组织的病理生理变化，此方法与人脑出血后演进过程基本相似，可用于研究脑水肿机制及临床药物作用机制。 缺点：注入脑内的血肿并非血管破裂造成的。血液注射过程中不可避免地有反溢现象和血液凝固堵塞针道的问题，血肿形态和大小重复性差。 注意：自体血常取材于实验动物的内眦、股动脉、心脏等处。内眦取血血液标本不易被污染，但取血为静脉血，与脑动脉出血的血液成分不符。动脉穿刺法血液成分与脑出血成分较一致。但股动脉穿刺法操作较复杂，成功率低。心脏穿刺法同样可以得到纯净的动脉血，操作较简便，损伤较小，但对操作人员技术要求较高，需熟练的操作技巧，反复穿刺动物又容易导致动物失血、感染死亡。 3、自发性脑出血法 此模型是研究成人型脑出血较理想的模型。 目前有实验采用基因培育方法培育出具有易出血的高血压基因动物，该动物自出生起数周开始血压自发升高，短时间内可发生自发性脑出血。这类动物也常用大鼠，是在已有高血压基因大鼠的基础上近亲繁殖培育，其相对于祖代血压更高，自发性脑出血发生率达80% ，发生出血的部位主要在大脑前内侧皮质、枕皮质和基底节。 优点：此模型将高血压与脑卒中结合，相似度极高地模拟人脑卒中病理。 缺点：这类动物只代表脑出血的一小部分原因—高血压，且动物培养成本高昂，繁育时间较长，动物体弱饲养困难，繁育的后代模型容易出现断种、变种、基因突变的情况，应用受到一定限制。 4、微球囊充胀法 造模方法：先将大鼠颅骨特定部位转孔，然后将固定在针头部位的微球囊通过该孔插入大脑尾状核头部，在20s内注入微球囊50mL液体，保留10min，观察微球囊对脑组织的压迫作用，然后回抽微球囊内液体，通过不断变化微球囊体积模拟不同大小血肿对脑组织的压迫作用。 缺点：微球囊并非血液成分，研究者并没有考虑脑出血后血肿的血液成分对脑组织的细胞毒性作用，血肿的脑细胞毒性作用的研究是人类需要解决的重要问题，因此近年来的脑出血研究基本上已摒弃了此方法。 总结 无论哪种方法建立动物脑出血模型均存在各自的优缺点。随着基础医学及各种新技术的不断发展，许多新的脑出血建模方法不断出现，但仍有缺陷，需要不断的研究和改进。建立标准化脑出血动物模型已成为研究者共同追求的目标，建模过程的各处理因素和影响因素统一化，减少对实验结果的影响，尽可能与人类脑出血的发病过程、病理生理过程趋向一致将是一个长期探索的过程。 |
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