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秦风拂面新虫 (初入文坛)
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无缝克隆构建重组载体，测序出错
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救救孩子吧，感觉毕不了业了 大家好，想请教一下论坛的各位大佬，小弟最近在做克隆表达，连接方式是同源重组，目的基因是链霉菌胰蛋白酶基因，载体是pwb980二代穿梭质粒（枯草芽孢载体），但是我把载体构建好之后，转到克隆宿主宿主大肠杆菌DH5α或者Top10里面，然后提质粒送样测序，测序结果显示基因起始位置（引物部分）总是有碱基缺失，且十几次的重组测序结果显示总是那几个位置有碱基缺失。 1. 引物有问题? 我提高了引物合成的纯化级别（ultrapage），也在不同的公司合成了相同的引物，再构建质粒，结果做了很多次都是相同的结果，都是在一样的位置缺失碱基，且引物合成都是做了质谱检测的。 2. 高保真酶的问题？ 我用过诺维赞的超高保真酶和上海生工的高保真酶，两种的酶的实验结果是一致的，都有碱基缺失。目的基因基因序列全长672bp，只有序列开始部分有碱基缺失，序列其它部分都是完整的，无错配缺失，如果酶的保真度不够，序列其它部分也大概率有碱基突变缺失的情况，不可能每次都只是引物端的那几个位置有碱基缺失吧。 3. 我也用了不同公司的无缝克隆试剂（诺维赞、上海生工、碧云天），重组质粒的测序结果都是在相同的位置有碱基缺失。 4. 为了排除引物合成残留的杂链扩增的目的基因的影响，我前前后后送了几十个转化子，测序结果显示基本都是相同的位置碱基缺失。 5. 模板问题？ 回头我又对我的模板DNA进行了测序，发现模板DNA完整，没有碱基缺失。 无缝克隆上游引物如下：gaggcgcaactcaagcttttgccGTGGTTGGCGGCACAAGAGC 小写部分是载体同源臂，大写部分是目的基因序列 测序比对结果（碱基缺失的部分都是基因开头部分） 缺失情形1 正确基因序列： GTGGTTGGCGGCACAAGAGC 测序基因序列： GTGGT GGCGGCACAAGAGC 缺失情形2 正确基因序列： GTGGTTGGCGGCACAAGAGC 测序基因序列： GTG TTGGCGGCACAAGAGC 缺失情形3 正确基因序列： GTGGTTGGCGGCACAAGAGC GTGGTTGGCGGC CAAGAGC 缺失情形4 正确基因序列： GTGGTTGGCGGCACAAGAGC 测序基因序列： GTGGTTGGC GCACAAGAGC 下游引物部分无碱基缺失或者突变 听别人说，有遗传压力的情形存在。就是导入的目的基因对大肠杆菌有毒害作用，会导致质粒复制出错，不知道这种说法是否可信。 请各位大佬赐教，如果大佬们能帮在下解惑，犹如再生父母  |
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加我微信18466397189??一起讨论 1.你的目的基因片段多少bp 2.测序是测的载体启动子端开始测的吗还是直接测序的目的基因 3.几段目的要无缝克隆在一个载体上？ 发自小木虫Android客户端 |
3楼2024-01-29 22:52:05
fengxueren
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5楼2024-01-29 23:01:00
2楼2024-01-29 22:47:10
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