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Western Blot 如何选择合适的内参？
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有些人提取蛋白会选择胞浆、胞核分开提取，不提取总蛋白。β-actin在胞浆中表达高效稳定，而总蛋白主要成分就是胞浆蛋白，所以β-actin可以作为总蛋白的内参。理论上细胞核内不表达β-actin，所以不能用于核蛋白内参。同理，细胞核内的蛋白用于做总蛋白内参，自然也不合理，内参自当选择与目的蛋白表达部位相同的蛋白才能有说服力。 而实际情况中，无论什么试剂盒，都不可能完全将胞浆、胞核蛋白完全分离开，提取时总会有交叉污染。即提取的核蛋白肯定会有β-actin，而胞浆蛋白也会有核蛋白的存在，所以你用两种蛋白做内参都能有结果，只是有的科学合理，有的不科学，没有说服力。 此外很多公司的内参抗体是用抗原片段制备的，不同的公司选择的片段不一样。以最常用的β-actin为例，有的公司选择N端，有的选择C端。选用N端的抗体均不能检测心肌和横纹肌中的actin条带。选用C端的抗体可以在肌肉细胞中检测到actin阳性信号。有时候在实验中检测内参时产生“组织特异性”，就是由于抗体选择不对造成的。 那么应该如何选择合适的内参呢，一般遵循以下原则： 1、样本种属来源 首先要考虑的就是实验样本来源于什么物种。哺乳动物的组织或者细胞样本，通常选择β-actin、Tubulin、GAPDH、Lamin B、PCNA、Na+/K+-ATPase等。植物来源实验样本则可以选择Plant actin、Rubisco等。其他来源样本研究较少，所以就应该参照文献报道，选择合适的蛋白作为内参。 2、目的蛋白分子量 选择内参抗体时，应该考虑目的蛋白分子量的大小。通常应该保证目的蛋白与内参蛋白分子量相差5KD以上。比如检测目的蛋白分子量为45KD，此时不适宜选择β-actin（42KD）作为内参，可以考虑选择GAPDH（36KD）作为内参。 3、目的蛋白表达部位 a、胞浆和全细胞蛋白：β-actin（43KD）、GAPDH（37KD）、Tubulin（55KD）等； b、胞核蛋白：PCNA（29KD）、Histone H3（17KD）等； c、核膜蛋白：Lamin B（66KD）等； d、胞膜蛋白：Na+/K+-ATPase（120KD）等； e、线粒体蛋白：COX IV（17KD）、VDAC1（30KD）等。 4、实际的实验环境 有些细胞在某些条件下内参表达会出现异常，使其不适合做内参。比如某些细胞中，由于组织缺氧、糖尿病等因素会导致GAPDH的表达增高，不适合做内参。在凋亡实验时，Lamin等也不适合作为内参。在加入抗癌和抗真菌药物时，Tubulin的表达易受影响，不适合作为内参。Lamin B不适合作为胚胎干细胞的内参，而PCNA不适合作为非增殖细胞的内参等。因此设计实验方案的时候应该考虑这些因素并查询相应文献，在实验过程中也应该注意如果内参表达出现异常，应考虑这方面因素。 5、不同的组织特异性 actin 即肌动蛋白，是细胞的一种重要骨架蛋白。actin 大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，包括alpha-skeletal muscle actin、alpha-cardiac muscle actin、alpha-smooth muscle actin和gamma-smooth muscle actin，其余两种广泛分布于各种组织中，包括beta-actin（β-non-muscle）和gamma-non-muscle actin。这些不同的亚型组织分布是不一样的，在肌肉组织中beta-actin分布就很少，心肌主要是alpha-cardiac muscle actin。因此不同的组织本来就应该选择不同的内参，不能一概而论。 |
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