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melodyxin

铜虫 (小有名气)

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[交流] 有没有同仁在做木霉菌的农杆菌介导转化？求交流！！！

做了三次实验，都没有得到阳性克隆。

我的实验具体步骤如下：

1、农杆菌的活化培养：
将含目的质粒的根瘤农杆菌AGL-1在含抗生素（kan 50μg/ml，carb 100μg/ml）的LB培养基上划线，挑取单克隆进行液体培养（LB培养基，kan 50μg/ml，carb 100μg/ml），28度，36-48h；收集菌体，用IM培养基（即共培养基）稀释至OD660=0.15，28度，200rpm培养4-6h；

2、里氏木霉菌的转化：
用 5-8ml无菌水从培养 4～7d的PDA斜面上洗下木霉菌的孢子，棉花过滤得到孢子悬液，血球计数板计数，然后用无菌水调节孢子浓度。取 100μl活化的农杆菌菌液和100μl稀释的孢子悬液混合，涂布在共培养平板的滤纸片（或硝酸纤维素膜）上 , 24-25度培养 48-60h。将滤纸揭下，反铺到含 100μg/ml 潮霉素B 和150μg/ml 头孢霉素的选择性 PDA 平板上 , 28 度培养48h。揭下滤纸 , 28 度继续培养 5～7d。

孢子悬液浓度取3个梯度：106、107、108/ml；预培养的农杆菌的OD660取四个梯度：0.40（约4h）、0.48（约5h）、0.55（约6h）、0.645（约7h）。滤纸和硝酸纤维素膜做转膜材料，单独涂布里氏木霉作为空白对照。

真的不知道是什么原因，诚心求教！！！！

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