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【求助】求助：做ELIsa时，怎样确定抗原、一抗、二抗最适反应浓度
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| 求助：做ELIsa时，怎样确定抗原、一抗、二抗最适反应浓度 |
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momocy
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ELISA最适工作浓度的选择及标准化操作 1最适工作浓度的选择 1．1间接法测抗体 酶标抗体工作浓度的选择：①用IgG进行包被，洗涤。②将酶标IgG用稀释液作一系列稀释后分别加入已包被的孔中，保温、洗涤。③加酸终止反应后，读取吸光度(A)。读取A值在1．0时的酶标抗体稀释度，作为酶标抗体的工作浓度。该酶标IsC的工作浓度应为1／1 600。 棋盘滴定法选择包被抗原工作浓度：①用包被液将抗原由1：50开始作比倍稀释后进行包被，洗涤。②将强阳性参考血清、弱阳性参考血清和阴性参考血清用稀释液作1：100稀释，加样，保温、洗涤。③加按工作浓度稀释的酶标IsC抗体，保温、洗涤。④加底物显色。加酸终止反应后读取A值。⑤选择强阳性参考血清的A值为0．8左右、阴性参考血清的A值小于0．1的包被抗的稀释度作为工作浓度，从中选取最适工作浓度。 1．2夹心法测抗原 在夹心ELISA法中，可用棋盘滴定法同时选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度。①抗体免疫球蛋白用包被缓冲液稀释至蛋白浓度为10．0、1．0和0．1微克／毫升，分别在ELISA板上进行包被，每一浓度包括3个纵行，洗涤。②在1个横行各包被孔中加入强阳性抗原液，另1横行加入弱阳性抗原液，第3横行加入阴性对照液，保温、洗涤。③将酶标抗体用稀释液稀释成3个浓度，例如1：1 000、1：5 000和1：25000。分别加入每个包被浓度的1个纵行中，保温、洗涤。④加底物显色。加酸终止反应后，读取A值。⑤以强阳性抗原的A值在0．8左右、阴性参考的A值小于0．1的条件作最适条件，据此选择包被抗体和酶抗体的工作浓度，从中选取包被抗体浓度和酶标抗体的稀释度。为了进一步节省试剂，可以此浓度为基点，缩小间距再进一步做棋盘滴定。 2测定方法的标准化 2．1加样 ELISA中除了包被外，一般需进行96孔加样。定性测定中有时不强调加样量的准确性。例如规定为加样1滴，如不具备相当的条件，要尽量使用相同口径的滴管，保持准确的加样姿势，使每滴液体的体积基本相同。在定量测定中，加样量应力求准确，最好采用量程准确的微量移液器。加样时应将液体加在孔底，不要加在孔壁上部，避免出现气泡。 2．2保温 在ELISA中，一般在加标本和结合物后，反应的温度和时间应按规定的要求，保温容器最好是水浴箱，可使温度迅速平衡。各ELISA板不应叠在一起。为避免蒸发，板上应加盖，或将板平放在底部垫有湿纱布的湿盒中。如用保温箱，空湿盒应预先放在其，以平衡温度。 2．3洗涤 洗涤在ELISA过程中不是反应步骤，但却是决定实验成败的关键。在标本和结合物的稀释液和洗涤液中加入聚山梨酯一类物质即避免非特异性吸附，在ELISA中最为常用。ELISA板的洗涤一般可采用以下方法：吸干孑L内反应液；将洗涤液注满板孔；放置2分钟，略作摇动；吸干孔内液，也可倾去液体后在吸水纸上拍干。洗涤的次数一般为3-4次，有时甚至需洗5-6次。如有专用洗涤机，应设定标准的洗涤步骤，并定期检查洗涤液，保证洗涤质量。 2．4比色 阴性对照颜色极浅，在定性测定中一般可采用目视比色。在目测法中，待检血清与抗原对照反应孔和待检血清与特异抗原反应孔均呈无色或极浅色，判为阴性；待检血清与抗原对照反应孔无色或极浅色，而与特异抗原呈橘黄色，判为阳性。如用比色计测定结果，其准确性则决定于ELISA板底的平整与透明度和比色计的质量。 网上转载的，有看到权威的再说。 [ Last edited by momocy on 2009-10-12 at 23:31 ] |
2楼2009-10-12 23:25:07
3楼2009-10-13 12:26:48
