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免疫共沉淀
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免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是一种利用抗原与抗体之间的专一性为基础，广泛应用于研究蛋白质与蛋白质相互作用的经典研究方法。 原理 如果细胞内两蛋白（A、B）有直接或间接的相互作用时，那么在温和的裂解条件下获得的蛋白样品中加入 A 蛋白的抗体将A蛋白沉淀下来，在细胞内与A蛋白直接相互作用的B蛋白或与其间接相互作用的C蛋白能一起被沉淀下来。使用western blot检测沉淀中是否存在B或C蛋白来确定B或C蛋白与A蛋白的相互作用。 用途 1、检测A、B蛋白在体内是否相互结合 2、分离与A蛋白相互作用的蛋白复合物 优缺点 优点： （1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态； （2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响； （3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。 缺点： （1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用； （2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用； （3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。 步骤 一、细胞的铺板与转染 1、提前一晚将293T细胞铺板至6 cm皿中，铺板量以达到相应的转染试剂要求为准； 2、用各实验室相应的转染试剂将以下质粒组合转染两皿细胞：flag 空载+HA-B；flag-A+HA-B；每质粒2微克。 二、免疫沉淀 1、转染24小时后，收获细胞，每皿加入500 μL裂解液，收集细胞至1.5 mL EP 管中，在冰上超声破碎细胞； 2、超声好后，4℃，12,000 g，离心30分钟，取400 μL上清液用于免疫沉淀，80 μL上清用作总蛋白并加入等体积的2Ⅹ loading buffer； 3、将400 μL上清加入用裂解液清洗了3遍的beads中，加入0.3-0.5 μg flag抗体，4℃孵育 3-4 小时； 4、4℃，2,000 rpm，离心3分钟，去除未结合的液体，留下beads沉淀，用预冷的蛋白裂解液清洗沉淀3次，每次5分钟； 4、最后一次去除清洗液，往沉淀中加入60 μL 2Ⅹ loading buffer，和总蛋白一起在沸水中煮沸 15 分钟。 三、Western Blot 检测 通过 SDS-PAGE 分离样品，利用全蛋白样品作为对照，检测flag-A和HA-B蛋白是否发生结合。 注意事项 1、对于内源的Co-IP检测应该用10cm皿来培养目的细胞，并维持较好的生长状态； 2、如果该实验用于新蛋白的鉴定，应注意抗体重链和轻链的影响； 3、该实验不能确定蛋白之间的相互作用是直接还是间接的。 |
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