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[交流] WB常见问题分析

WB常见问题分析
蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB

是很常规的生物学实验，是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。不过真正在实验室里做实验的小伙伴恐怕都遇到过各种实验结果不完美的状况，总结WB实验中可能会遇到的问题，分析可能的原因及对应的解决方案。下面我们列举一些常见问题一个个分析。
1.胶片是一片空白，是怎么回事？
答：如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。
1）二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光；
2）ECL底物中H2O2不稳定，失活；
3） ECL底物没覆盖到相应位置；
4）一抗选择不当；
5）二抗失活。
2.蛋白条带位置（大小）不对咋整？
答：可能的原因有：
1)胶浓度不对，不同浓度的胶跑出的蛋白条带的位置可能有所偏差，可以调整浓度
2)抗体孵育不充分,建议增加抗体浓度，延长孵育时间
3）酶失活，建议直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物
4）目的蛋白存在翻译后修饰或剪切体，建议查询相关文献确定
5）标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低，建议设置阳性对照比对结果，增加标本上样量
3.有很多杂带咋回事？
答：可能的原因有：
1）目的蛋白有多个修饰位点，本身可以呈现多条带，建议查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小
2) 样本处理过程中目的蛋白发生降解,建议加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作
3）杂蛋白多，建议处理目的蛋白
4）抗体特异性不强，建议使用特异性强的抗体
5）抗体孵育时间过久，建议减少抗体孵育时间
6）二抗与抗原有交叉反应，建议选择合适的封闭物
7）二聚体或多聚体存在，建议增加蛋白质变性过程及强度
8）底物显色与曝光时间过长，建议缩短显色及曝光的时间
4.背景有黑色斑点或有不均匀的白色斑点以及暗背景上白色带
答：可能的原因有：
1）抗体与封闭试剂反应，建议使用前过滤封闭试剂
2）HRP含量过高，建议降低酶联二抗的浓度
3）HRP偶联二抗中有聚集体，建议过滤二抗试剂，去除聚集体
4）抗体分布不均匀，建议孵育抗体时使用摇床
5.为什么我的细胞提取液中没有检测到目的蛋白？
答：可能的原因有：
1）细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞；
2）抗体不能识别目标蛋白，多看看说明，是否有问题；
3）可能是没有保持低温操作，样品保存不当，样品放置时间过长；
4）细胞中的蛋白质被酶降解掉了，可加入蛋白酶抑制剂，抑制蛋白酶活性。
6.我的目的带很弱，如何加强？
答：1）可以加大抗原上样量，这是最主要的；
2）也可以将一抗稀释比例降低；
3）还可以延长曝光时间。
7.我做的蛋白质分子量很小（10KD），请问怎么做WB？
答：1）可选择孔径0.22um的PVDF膜或者NC膜，转膜时间缩短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE体系；
2）也可以选择PSQ 膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。其他按步骤即可。
8.WB中抗体的可以重复应用吗？
答：抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2－3次。稀释后应在2－3天内使用，4度保存，避免反复冻融。

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1楼 2023-11-22 14:27:45

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