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科研小努力

新虫 (小有名气)

[交流] 免疫荧光教程

1、细胞准备


(1)取出生长状态良好的细胞,弃培养基,消化重悬细胞。



(2)将24孔圆形爬片放入24孔板的孔中。



(3)根据细胞生长特性取适量细胞于已铺爬片的24孔板中,放入37℃孵箱培养。

2、固定


(1)取出细胞,弃去培养基,用PBS洗细胞3次。



(2)每孔加入1mL的4%多聚甲醛,室温固定10-20min,弃去多聚甲醛;



(3)加入1mL的PBS清洗细胞,重复两次。

3、通透


(1)每孔加入1mL的0.5% Triton-X100 ,室温10min,弃去Triton-X100。



(2)加入1mL的PBS清洗细胞,5min,弃PBS。重复两次。

4、封闭


每孔中加入1mL的3%BSA封闭液,室温封闭1h。弃封闭液。

5、一抗结合


(1)向爬片上滴加稀释好的一抗,用锡箔纸包住24孔板外面,轻柔的将24 孔板放置于4℃冰箱中,过夜孵育。



(2)加入1mL的PBS清洗细胞,5min,弃PBS。重复五次。

6、二抗结合


(1)加封闭液稀释的二抗室温避光孵育1h。



(2)加入1mL的PBS清洗细胞,5min,弃PBS。重复五次。

7、DAPI染色


(1)按照1:4000比例用1×PBS稀释DAPI工作液(参照厂家说明书),并向每个孔中加入1mL的DAPI工作液,避光静置染色10min。



(2)加入1mL的PBS清洗细胞,5min,弃PBS。重复三次。

8、封片及检测


(1)将爬片小心取出,用吸水纸吸干多余液体,加5μl的抗荧光淬灭剂到载玻片上。



(2)将爬片倒置载玻片上,周围涂指甲油固定。



(3)4℃暂存或直接激光共聚焦显微镜拍摄。
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