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一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（红色荧光）实验步骤
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一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（红色荧光）实验步骤 自备仪器耗材： 1)试剂 PBS（含1%BSA） 缓冲液( pH7.2～7.4)， 目的是减少离心造成的细胞损失。 2)仪器 流式细胞仪、离心机。 对照设置： 阴性对照：排除细胞本底、药物处理等原因产生荧光背景以及非特异性染色造成的影响。准备一组细胞作为阴性对照， 第8步标记工作液配制时不添加TdT酶，其余操作与实验组相同。 实验步骤 1.收集细胞并进行计数，每组取1×106个细胞，300×g离心5min，弃上清。 注：若样本为贴壁细胞，凋亡细胞会有部分悬浮于上清中，上清中的细胞也要收集。 2.加入200μLPBS（含1%BSA）重悬细胞，加入200uL Fixation Buffer，室温固定60min（推荐使用摇转方式，或每15min 混匀一次）。 3.加入1mL PBS（含1%BSA），600×g 离心5min，弃上清。 4.加入200uL Permeabilization Buffer，冰上破膜10min。 注：破膜温度过高或者时间过久会导致细胞破碎，因此建议Permeabilization Buffer解冻后放置在4℃ , 待使用前取出 ; 另外破膜时间最长不要超过15min。 5.加入1-2mL PBS（含1%BSA）终止破膜，轻轻吹打混匀后，600×g离心5min，弃上清。 6.加入200uL TdT Equilibration Buffer，轻轻吹打混匀，37 °C 平衡15min。 7.600×g离心5min，弃上清，收集细胞沉淀。 8.按照分组参考下表配制标记工作液，每个样本加入100uL反应液（充分混匀，现配现用）。 组分 检测样本 阴性对照 TdT Equilibration Buffer 70ul 80ul Labeling Solution 20ul 20ul TdT Enzyme 10ul 0ul 注： ①TdT Equilibration Buffer使用前，室温静置直至完全溶解。冰冻的平衡液融化后可能会出现钴盐结晶，此为正常现 象。使用前涡旋混匀。 ②Labeling Solution使用前，请置于冰上溶解，待完全溶解后离心，用枪头吹打混匀。 ③TdT酶对温度较敏感，请严格保存于-20℃ , 使用前取出，使用后立即放回。 ④配制标记工作液时，建议不要涡旋。 9.37℃避光孵育60min（每20min轻轻摇晃混匀细胞） 。 10.加入1mL Stop Solution轻轻吹打混匀，室温静置5min，加入300 500uL PBS(含1%BSA)，600×g 离心5min，弃上清。 11.加入200uL PBS（含1%BSA）重悬细胞，上机检测。 (为避免荧光淬灭，请尽快上机检测) 注意事项： 1.本产品仅限于专业人员用于科学研究，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅。 2.为了您的安全和健康，操作时必须戴口罩、手套、实验服和其它生化实验室防护措施。。 3.用于该试剂盒的检测样本最低细胞数目不低于5×105个。 4.实验中需要重悬细胞的步骤，用移液器轻轻吹打细胞10-20次，吹打时请勿将枪头中的液体完全吹出，避免造成细胞损 伤和产生过多的气泡。 5.离心去上清的操作要小心谨慎，避免造成细胞损失。 6.Labeling Solution 和TdT酶应避免反复冻融和涡旋操作。 |
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