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细胞转染
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细胞转染是指将外源分子（如DNA、RNA等）导入真核细胞的技术。目前，其已成为实验室工作中最常涉及的基本方法，是研究基因表达调控、突变分析等的常规工具。 转染方法大致可分为物理介导（如电穿孔法、显微注射和基因枪等）、化学介导（脂质体及其代替物、磷酸钙等）和生物介导（各类病毒，包括腺病毒、慢病毒、逆转录病毒、腺相关病毒等）三类途径。 细胞转染又分为瞬时转染和稳定转染，瞬时转染是指外源基因进入受体细胞后，存在于游离的载体上，不整合到细胞的染色体上，基因表达维持时间较短，通常在96h以内；稳定转染是指DNA整合到宿主细胞的染色体中，使宿主细胞可长期表达目的基因。 目前，大多采用依据不同质粒载体含有的抗性标志选用相应的抗生素对靶细胞进行筛选，常用的抗生素有嘌呤霉素（Puromycin）、G418（Geneticin）等。 1、主要有下面几种 化学法：磷酸钙法、DEAE-右旋糖苷法、阳离子脂质体法； 物理法：电穿孔法、显微注射法、biolistic颗粒传递法； 病毒介导法：逆转录病毒、腺病毒 A. 阳离子脂质体法：带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞。 特点：简单通用，适用性广，转染效率高，重复性好，但转染时需除血清，转染效率随细胞类型变化大。由于脂质体复合物与贴壁细胞的接触机会远大于悬浮细胞，所以贴壁比悬浮转染效率要高。悬浮细胞建议使用电穿孔法。 B. 电穿孔法：利用高压电脉冲对细胞膜的干扰，使其形成利于核酸进入的微孔。 C. 逆转录病毒（RNA）：通过病毒中膜糖蛋白和宿主细胞表面的受体相互作用进入宿主细胞，之后反转录酶启动合成DNA并随机整合到宿主基因组中。 特点：稳定转染，可用于难转染的细胞、原代细胞，体内细胞等，但携带基因不能太大。 D. 腺病毒（双链DNA）：先和细胞表面的受体结合，继而在αV整合素介导下被细胞内吞。 特点：可用于难转染的细胞。 2、影响转染的因素 血清：血清影响复合物的形成，降低转染效率。 阳离子脂质体和DNA的最佳量在使用血清时会有所不同，因此想在转染培养基中加入血清时要进行条件优化。大部分细胞可以在无血清培养基中几个小时内保持健康。 抗生素：比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。 细胞代数：转染前细胞最好经过1-2次传代保证细胞生长旺盛容易转染，注意贴壁细胞一旦长满就不好转染。 细胞铺板密度：一般转染时，贴壁细胞密度为70%-90%，悬浮细胞密度为2*10^6--4*10^6 细胞/ml 时效果较好。确保转染时细胞没有长满或处于静止期。铺板细胞数目的增加可以增加转染活性和细胞产量。 DNA质量：DNA质量对转染效率影响非常大。一般的转染技术基于电荷吸引原理，如果DNA不纯，如带少量的盐离子，蛋白，代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成和转染的进行。 |
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