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鬼笔环肽—细胞骨架定位工具
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鬼笔环肽 — 细胞骨架定位工具 鬼笔环肽（phalloidin）是一种强烈毒素，最早是在一种剧毒蘑菇(Amanita phalloides（Vaill ex Fr.）Secr.) （伞菌目，毒伞属的毒伞）中分离出来，其本身是一种双环七肽，肉眼观察呈无色，细针状结晶。鬼笔环肽中毒的主要症状是由于肝细胞的破坏引起的急性饥饿。中毒机制是鬼笔环肽特异性结合在细胞F-肌动蛋白（F-actin）亚基之间的界面，将相邻的亚基锁定在一起，防止其解聚并中毒细胞。 细胞骨架主要是由微丝，微管和中间丝所组成的，肌动蛋白分成肌动蛋白单体（G-actin）和纤维状蛋白单体（F-actin），是微丝的主要组成部分，组装过程可简单理解为由G-actin结合变成F-actin。 鬼笔环肽与F-actin的结合比与肌动蛋白单体（G-actin）的结合更紧密，从而导致肌动蛋白亚基从丝端解离的速率常数减小，防止了丝解聚而基本稳定了肌动蛋白丝。根据这一特性，含鬼笔环肽的荧光标记已广泛用于显微技术中，以在生物医学研究中将F-actin可视化。 1、实验流程 试剂配制： 1. 储存液的配制：使用前请用离心机离心，将离心于管底的冻干粉末按照1T配1μL的比例，溶解在甲醇溶液中，如300T粉末溶解在300μL甲醇中。置于-20°C避光保存； 2. 配制工作液：根据实验需求，使用PBS将储存液按照1:40-1:200稀释，混匀备用。 固定细胞染色： 以下描述了贴壁细胞的染色程序。鬼笔环肽也可用于染色固定的冷冻或石蜡组织切片，以及酵母和真菌。 1. 用PBS洗涤细胞3次。 2. 用含有4%甲醛的PBS溶液冰上固定细胞15分钟。（注意：甲醇在固定过程中会破坏肌动蛋白。因此，最好避免使用任何含有甲醇的固定剂或其他溶剂型固定剂。优选的固定剂是无甲醇甲醛） 3. 用PBS清洗细胞3次。 4. 在室温下，用含0.5% Triton X-100的PBS溶液透化细胞10分钟。 5. 用PBS清洗细胞3次。 6. 用200μLPBS稀释1μL荧光鬼笔环肽母液，加到每个要染色的爬片或腔室。将染色溶液在室温下放置20分钟。（注意：染色量可根据样品调整。为避免蒸发，请将爬片放在有盖的容器内，并在孵育期间盖住腔室） 7. 用PBS清洗2-3次。 8. 使用荧光显微镜成像。在PBS中荧光鬼笔环肽具有足够的光稳定性，但为了获得最佳效果，我们建议使用抗淬灭封片剂。 活细胞染色： 荧光标记的鬼笔环肽不具有细胞通透性，因此尚未广泛用于活细胞。然而，鬼笔环肽仍可通过胞饮或其他机制标记活细胞。一般来说，活细胞染色需要大量的染色剂。作为一种选择，荧光鬼笔环肽也可被注射到细胞中，用于监测肌动蛋白分布和细胞运动。 |
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