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新虫 (小有名气)

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专业: 实验动物学

[交流] 细胞粘附实验

细胞粘附实验实验原理：细胞黏附性是维持组织结构稳定的基本条件，也是细胞运动和发挥功能的调节因素，并且对细胞的增殖、分化有重要影响。通常可分为两类，即细胞与细胞黏附和细胞与基质黏附。

机体内许多细胞，如上皮细胞，需要牢固地定在某处发挥功能；另一些细胞，如白细胞，活跃运动，就需要不断调节细胞黏附。细胞黏附性的改变在肿瘤转移过程中也发挥着重要作用。恶性肿瘤具有从原发瘤分离及在体内扩散的能力，提示这些细胞在相互识别及黏附机制方面发生了改变。

实验方法：

1、将4.5×105个Hep3B细胞/孔传代于无菌6孔培养板中。

2、培养24h后，用Lipofectamine TM 2000将37LRP siRNA转染Hep3B细胞（两个平行孔，Lipofectamine TM 2000转染具体操作见方法7），转染后的细胞置37℃、5％CO2培养箱培养，48h后收集细胞。同时各有两个平行孔的细胞进行阴性对照转染及不行转染。转染终浓度即siRNA终浓度为100nmol/L。

3、培养48小时后收集细胞，用0.25%胰酶将贴壁培养细胞（约1×106个）从壁上消化下来并制成单细胞悬液。

4、用无血清MEM培养基将Matrigel配制成10ug/250ul（1:300）的人工基底膜胶备用。

5、96孔板每孔中铺Matrigel 2ug/50ul，放于超净台中风干过夜。

6、96孔板每孔加入适量无血清MEM细胞培养液(或PBS或生理盐水)，放置60－90分钟，洗去多余的胶；

7、取转染、阴性对照转染及不行转染的Hep3B细胞以4×103/孔接种在铺胶的96孔板中，设3个重复孔，放入37℃、5％CO2培养箱中分别培养20min、40min、60min。

8、在相应时间点取出96孔板，吸出培养液，用PBS洗3遍，洗去未粘附细胞。

9、每孔加入100 ul甲醇，固定15min。

10、每孔加入100 ul姬姆萨染液，染色15min，蒸馏水洗去染液。

11、在200倍显微镜下计数粘附细胞数量（每孔在固定位置取8个视野）。

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1楼 2023-10-09 10:33:43

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