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肿瘤细胞侵袭实验步骤
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实验方法 1、复苏代数靠前的肿瘤细胞，在含有10% FBS的培养基中预先培养2-3代，待细胞汇合达到80%左右，饥饿处理18-24小时。 2、准备铺胶： a）4 °C溶matirgel胶过夜 b）将细胞小室、培养板和枪头等于4°C 预冷 c）用无血清的冷培养基稀释matirgel胶至一定浓度，加入到细胞小室的上层（按照产品说明书的推荐比例和体积），轻轻摇晃使胶均匀铺在膜上。以上操作在冰上进行 d）立即将铺好matrigel胶的细胞小室置于培养板中，于37°C孵育1小时左右，matirgel胶可由液体凝成固体，吸走多余的或者未凝的胶 3、细胞用PBS清洗一次，胰酶消化，然后用包含5% BSA的无血清培养基中和，1500rpm离心5-10min。 4、用无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度 5、取上述细胞液加入小室，下室（培养板）加入含有10% FBS的培养基。不同规格的小室和培养板所加的体积不同，具体参考产品说明书 6、37 °C孵育24至72小时，依据肿瘤细胞类型而定 7、孵育结束，小心取出细胞小室，吸掉小室上层培养液，PBS清洗一遍，70%酒精或者4%多聚甲醛固定5min，0.5%结晶紫（2%乙醇或PBS溶解）染色20min，然后进行第8步或者第9步。 8、PBS清洗两次以去除多余的染料，立即用棉签擦去滤膜上层的细胞，自然静置风干。显微镜下观察滤膜下层的细胞，随机选取不同的视野计数并算平均值。 9、结晶紫溶解滤膜下层细胞，然后用33%醋酸脱色，将结晶紫完全洗脱下来，洗脱液可在酶标仪上570nm读取OD值。这种方法可以避免视野下细胞穿透不均匀带来的误差。 10、计数：Transwell侵袭实验结果统计分析有两种方法 直接计数法：通过给细胞染色，直接在镜下计数。选择不同的视野拍照（一般选择呈现视野中穿过的细胞），计数的结果可做成统计图，辅助呈现数据。 间接计数法：主要用于穿过细胞过多，而无法通过计数获得准确的细胞数所采用的方法，与常用的MTT实验是同样的原理。它包括：MTT法、 荧光试剂检测、 结晶紫检测。 |
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