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细胞实验 | CCK-8实验锦囊非你莫属
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一、原理： Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）试剂含有WST-8，它在电子载体（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比，因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。 CCK-8法因其高灵敏度，无放射性的比色检测法的优点，可替代传统的MTT法。 二、检测步骤： 向96孔的各孔中加入100μl细胞悬液。 使用适当的培养基制备50,000-100,000个/ml的细胞悬液。 在37℃下预孵育培养板。 向各孔中加入各浓度的待测溶液（使用培养基或PBS来制备溶液）10μl。 37℃下孵育。 向各孔中加入10μl的CCK-8溶液。如果待测溶液有还原性，测定不含细胞，但含有CCK-8的待测溶液在450 nm处的空白吸光度。如果该吸光度很小，则可以直接加入CCK-8，如果吸光度相对较大，则需要除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的100μl培养基和10μl的CCK-8 进行检测。 37℃下孵育1-4小时。白细胞可能需要培养较长时间。 测定450 nm处的OD值。 活力计算 细胞活力*（%）=【A（加药）-A（空白）】/【A（0加药）-A（空白）】×100 A（加药）：具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的吸光度 A（空白）：具有培养基和CCK-8溶液而没有细胞的孔的吸光度 A（0加药）：具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度 *细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力 三、存在的各种疑问： 1. 一个孔中应接种多少个细胞？ 当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1,000个/孔（100μl培养基）。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2,500个/孔（100μl培养基）. 如果要使用24孔板或6孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。 2. 能否用384孔板进行试验？ 可以。向各孔中加入培养基体积10%的CCK-8溶液，如果加入的CCK-8体积太少，可以先将CCK-8溶液稀释1倍，然后加入培养基体积20%的量。 3. 酚红会影响检测吗？ 不会。培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。 4. CCK-8与胸苷结合检测之间是否有 相关性》 有。然而，请注意由于CCK-8使用的检测原理与胸苷检测的不同，因此结果可能不同。 5. CCK-8能否检测细菌细胞？ 可以检测E.coli，但不能检测酵母细胞。向100μl E.coli培养液中加入10μl CCK-8溶液，并培养1-4个小时或过夜。 6. CCK-8稳定吗？ CCK-8在0-5℃下能够保存至少6个月，在-20℃下避光可以保存1年。如果需要长期保存，我们推荐-20℃的储藏条件。 7. CCK8能否对活细胞进行染色？ 不能。因为 CCK8 的主要成分是一种水溶性的四唑盐（WST8），并通过电子载体1-Methoxy PMS将活细胞中的电子交换到培养基中的WST8上。由于生成的物质也是高度水溶性的，因此CCK8不能对细胞进行染色。 8. CCK8检测溶液对细胞是否有毒？ CCK8溶液自身因为高浓度的1-Methoxy PMS的存在而具有一点毒性。但是，加到培养基中的CCK8是没有毒性的，因为被稀释了10倍。因此，长时间的培养，如过夜或者培养数天是可以的。同一个细胞培养液在CCK8检测后还可以用于其他细胞增殖检测，如结晶紫检测，中性红检测或者DNA荧光检测等。由于每种细胞对于CCK8的耐受力都不同，因此在需要进行长时间培养时，先检测一下细胞在加入CCK8培养后的活力。 9. 在做加药实验时，药物对测定是否 有影响？如何解决？ 有时会有影响。如果药物具有还原性，会和CCK8发生显色反应，增加吸光度。解决办法：首先要确认药物是否有吸收，在含有药物的培养基中加入CCK8，测定450 nm的吸光度，如果它的吸光度比不含药物的培养基（加CCK8）的吸光度高，则证明药物有影响，可在加CCK8之前更换培养基，去掉药物的影响。 10. 每次测定的数值不一样，是什么原因？ 如何解决？ 可能会有以下几个原因：1.当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。一般情况下，最外一圈的孔只加培养基，不作为测定孔用。2.有可能会因为CCK8沾在壁上而产生误差，建议在加入CCK8后，轻轻敲击培养板以帮助混匀。3.每孔的细胞数量过多或过少。请预先摸索条件。 12. 如何设定空白对照？ 在不含细胞的培养基中加入CCK8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验（细胞毒性实验）时，还应考虑药物的吸收，可在不含细胞，加入药物的培养基中加入CCK8，培养一定的时间，测定450nm的吸光度作为空白对照。 13. 哪些物质会影响CCK8的测定？ 当有还原性物质存在时会影响CCK8的测定，例如含有维生素C的Glucose等（一般培养基中的量不多，酚红或血清不影响测定）。在有酚红存在的情况下，会增加空白吸收，但不影响测定，扣除空白吸收即可。 14. 设定参比波长的目的是什么？ 必须设定吗？ 不一定要设定。CCK-8试剂在参比波长没有吸光度。设定参比波长的目的是为了取出由于样品混浊所带来的吸收。 15. 在CCK-8显色过程中，如何终止反应？ 有一下几种方法（96孔板）：1、在显色反应后，将培养板放置4℃冰箱内。2、每孔加10μl 0.1 M HCL溶液。3、每孔加10μl 1%（w/v）的SDS（十二烷基硫酸钠）溶液。注意：反应停止后，应在24小时之内测定。 16. 必须预培养细胞吗？ 不一定。如果要向保持细胞的最好状态，建议预培养细胞。如果不做细胞预培养，细胞内的脱氢酶可能会不稳定。也有人不做细胞预培养，但在做标准曲线和检测时需要统一检测条件。 17. CCK-8试剂的保存条件？ 在避光条件下CCK-8试剂在 4℃可保存一年。如果需要保存较长时间的话，推荐在-20℃下保存。但是CCK-8若反复解冻和冰冻将会增加空白吸收，从而影响检测结果，若经常使用可将试剂存放在4℃冰箱内保存。 18. 预培养后，更换培养基需要细胞 计数吗？ 一般情况下用胰蛋白酶处理对数增长期的细胞，用血球计数盘计数，制备成一定浓度的细胞悬液即可。如果想要精密计数细胞的话，可以预培养后取培养基用血球计数盘进行计数。 19. CCK-8对于不同的细胞，灵敏度是否 一样？ 不一样，悬浮细胞与贴壁细胞相比较难染色。对于贴壁细胞，一般加入CCK-8培养1-4小时吸光度已经很高，但对于悬浮细胞则可能吸光度较低，可以通过延长CCK-8的加入时间或增加细胞数量来解决。 20. 悬浮细胞和贴壁细胞在数量上 有何区别？ 悬浮细胞由于染色比较困难，一般需要增加细胞数量和延长培养时间。贴壁细胞染色比较容易，若细胞数量过大，有时吸光度会超过酶标仪的读数。 21. 应该每次做标准曲线吗？ 建议每次做。虽然细胞是一样的，但是细胞的状态不一定一样，对于状态不一样的细胞，建议每次做标准曲线。如果试剂的批号不一样，灵敏度可能会有轻微的差异，对于不同的批号建议分别做标准曲线。 |
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