24小时热门版块排行榜

返回列表

【有奖交流】积极回复本帖子，参与交流，就有机会分得作者合肥肽库生物的 4 个金币，回帖就立即获得 1 个金币，每人有 1 次机会

合肥肽库生物

新虫 (著名写手)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 2777.7
帖子: 1142
在线: 51.9小时
虫号: 28386431

[交流] 线粒体靶向抗氧化肽SS-31对脓毒症大鼠血管通透性的保护作用

[摘要] 目的探讨线粒体靶向抗氧化肽SS-31对脓毒症大鼠血管通透性的影响及其机制。方法 40只12周龄SD大鼠（雌雄各半，体质量约220 g）分成5组（n=8）：假手术组（只开腹，不结扎盲肠和穿孔）、脓毒症组（盲肠结扎穿孔术制作脓毒症模型）、常规治疗组（conventional treatment，CT组，脓毒症模型12 h后，股静脉输注LR）、SS-31早期治疗组（常规治疗基础上在盲肠结扎穿孔前30 min尾静脉给予SS-31 3 mg/kg）和SS-31晚期治疗组（常规治疗基础上在盲肠结扎穿孔12 h后从股静脉输注LR联合SS-31）。通过荧光蛋白透过率的方法测定大鼠肺脏和肾脏的血管通透性，伊文思蓝染色透过率检测大鼠肠道通透性；离体取原代肺静脉内皮细胞观察LPS刺激（LPS组）及SS-31预处理（SS-31预处理组）后对内皮细胞的闭锁小带蛋白1（zonula occludes-1，ZO-1）的表达和细胞跨膜电阻（trans electric resistance，TER），以及活性氧（reactive oxygen species，ROS）的影响，以无血清的基础培养基培养24 h的细胞作为正常对照组。结果 ① 与假手术组比较，脓毒症组大鼠肺脏、肾脏血管以及肠道组织的通透性明显增加，线粒体功能降低（P < 0.01）；采用常规治疗（LR联合头孢呋辛钠和多巴胺同时输注）尽管可以降低脓毒症大鼠的通透性和减轻线粒体功能损害，但与脓毒症组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；SS-31治疗可明显降低脓毒症大鼠肺脏、肾脏血管以及肠道组织的通透性和增加线粒体功能，与常规治疗组比较，差异有统计学意义（P < 0.01），其中SS-31早期治疗效果比晚期治疗效果更好。②与正常对照组比较，LPS组ZO-1表达明显降低，细胞结构排列紊乱，TER明显降低，ROS含量增加；SS-31预处理可使ZO-1表达增加，细胞间连接紧密，TER明显增加，ROS含量明显降低。结论 SS-31对脓毒症大鼠的血管通透性有保护作用，其机制可能与抑制线粒体氧化应激有关。
脓毒症是指机体对感染的反应失调而致的危及生命的器官功能障碍，是严重创伤、烧伤后的常见并发症和主要死亡原因之一。据统计全球每年有2 100万脓毒症患者，死亡率高达20%~50%[1]。多数脓毒症患者存在严重的血管渗漏，目前认为血管渗漏是脓毒症主要的病理生理变化之一，可引起组织水肿甚至器官功能障碍，严重时可危及生命。氧化应激损伤被认为是重要的发病机制之一。氧化应激是指机体遭受各种有害刺激后，体内的活性自由基产生过多，氧化作用远远超出了机体对氧化物的清除能力，从而产生大量的氧化中间产物，导致炎性细胞浸润和组织损伤。研究表明，缺血再灌注损伤会引起氧化应激，可导致大脑、心脏等重要器官功能损伤[2]，动脉粥样硬化、糖尿病[3-4]等。针对氧化应激的发生机制提出了相应的抗氧化应激治疗措施，但效果仍不理想。
SS-31是一种新型的线粒体靶向抗氧化剂，由加拿大教授Szeto和Schiller发现并命名，主要分布在线粒体内膜上，可直接清除活性氧（reactive oxygen species，ROS），已发现SS31靶向线粒体并保护神经元免受Ca2+诱导的线粒体肿胀。以往研究表明，SS-31对缺血再灌注心脏、阿尔兹海默症、糖尿病等有很好的保护作用[5-7]，但SS-31对脓毒症血管通透性是否也有保护作用不清楚。为此，本研究采用盲肠结扎穿孔术复制大鼠脓毒症模型，观察SS-31早期和晚期治疗对脓毒症大鼠血管通透性的保护作用，并初步探讨其保护机制。
1 材料与方法
1.1 试剂
实验试剂有：SS31，DArg-Dmt-Lys-Phe-NH2，相对分子质量639.8 g/mol，规格100 mg，溶于生理盐水，配成浓度为1 mg/mL；异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白（albumin-fluorescein isothiocyanate conjugate，FITC-BSA）购自美国Sigma公司，货号A9771，使用浓度9 mg/kg；伊文思蓝（Evans blue）购自Sigma公司（美国），规格100 g，用生理盐水配制浓度为1.5%；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）购自Sigma公司（美国），货号L2630，用PBS配制成浓度为10 mg/mL；ROS测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所（中国）；闭锁小带蛋白1（zonula occludes-1，ZO-1）抗体购自中国博士德公司，兔抗大鼠，一抗浓度1:200；2, 6-二异丙基苯胺（2, 6-Diisopropylaniline，DAPI）购自中杉金桥公司（中国）。
1.2 大鼠脓毒症模型制备
取12周龄SD大鼠40只，雌雄各半，体质量220 g左右[陆军军医大学实验动物中心提供，生产许可证号为SCXK（渝）20170002，使用许可证号为SYXK（渝）20170002]。根据文献[8]方法用戊巴比妥钠（45 mg/kg）腹腔麻醉，碘酒消毒腹部，沿腹直线剪开腹部，切口约3 cm，暴露盲肠，将粪便充盈至盲端，距盲端0.7 cm处结扎、穿孔，大小约0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，使粪便流入腹腔，引起感染，复位盲肠，离断两侧大网膜，缝合伤口，按2 mL/100 g大鼠腹腔注射无菌生理盐水，大鼠放回笼子，禁食不禁水，用于后续实验。
1.3 实验分组
大鼠分成5组：假手术组、脓毒症组、常规治疗组（conventional treatment，CT）、SS-31早期治疗（Ear）组和SS-31晚期治疗（Lat）组。假手术组只开腹，不结扎盲肠和穿孔；脓毒症组：用盲肠结扎穿孔术制作脓毒症模型；常规治疗组：在脓毒症模型12 h后，股静脉输注LR（含头孢呋辛钠和多巴胺），输注3 h后，MAP>65 mmHg；SS-31早期治疗组：在盲肠结扎穿孔前30 min尾静脉给予SS-31（3 mg/kg），在脓毒症模型12 h后，输注LR 3 h（含头孢呋辛钠和多巴胺）；SS-31晚期治疗组：在盲肠结扎穿孔12 h后从股静脉输注LR（含头孢呋辛钠和多巴胺）联合SS-31（3 mg/kg），输注3 h。输注完成后检测大鼠的肺脏、肾脏和肠道通透性以及线粒体功能。
培养肺静脉内皮细胞，分成正常对照组、LPS组、SS-31预处理组。正常对照组：实验前1 d用无血清的基础培养基培养24 h；LPS组：用无血清的基础培养基培养24 h后，用2 mg/mL的LPS刺激12 h；SS-31预处理组：用无血清的基础培养基培养24 h后，加入0.1 μg/mL SS-31预刺激30 min，再加入LPS刺激12 h。检测内皮细胞的ZO-1、跨膜电阻（trans electric resistance，TER）和ROS。
1.4 实验方法
1.4.1 肺脏和肾脏通透性检测
大鼠麻醉后固定，经颈静脉插管注射FITC-BSA (9 mg/kg)，2 h后经颈静脉注射稀肝素40 mL开始冲洗，结扎腹主静脉，剪断腹主动脉，冲洗至肺脏和肾脏变白，取左肺上叶和整个左肾，称量，剪碎肺组织，匀浆，8 000×g，4 ℃离心10 min，取上清液，用荧光分光光度计测定组织的光密度(波长500 nm，530 nm)，同时使用多功能酶标仪测定组织匀浆液的光密度，并计算匀浆液中荧光白蛋白浓度和总蛋白浓度。以组织上清液荧光白蛋白浓度/总蛋白浓度代表肺脏和肾脏的血管通透性。
1.4.2 肠道通透性检测
肠道通透性测定通过伊文思蓝通透率法。各组大鼠处理完毕后断头处死，在距离胃幽门约6 cm处取1段约6 cm长的小肠，用预热的PBS轻轻冲洗肠腔，将小肠的一端结扎，从另一端注入200 μL浓度为1.5%的伊文思蓝，并将其结扎，制成肠囊。将肠囊置于37 ℃水浴中2 h后，用PBS冲洗至澄清，然后将肠组织在50 ℃烤箱中烤24 h，取出称取肠干质量，后加2 mL甲酰胺溶液放置于37 ℃ 24 h，取溶液在分光光度计上测定波长655 nm处光密度值[D（655）]，并计算出每克肠含伊文思蓝的质量（mg/g）。
1.4.3 原代内皮细胞提取
正常SD大鼠麻醉后，腹腔注射肝素钠，10 min后打开胸腔，分离左、右两侧肺静脉，置于无菌PBS中，纵向剖开肺静脉血管，并剪成约1 mm×1 mm×1 mm小块，PBS多次清洗组织，将肺静脉内面贴于培养瓶，加入DMEM-F12完全培养基，待组织完全干燥后，使培养基浸没组织块，37 ℃孵箱中培养3 d，所得细胞经鉴定为内皮细胞[9]，取3~5代内皮细胞用于实验。
1.4.4 TER测定
接种1×105/mL细胞于Transwell小室中，经2~3 d待细胞单层长满后，用跨膜电阻测定仪EVOM2（美国World Precision Instruments公司）测量，垂直插入电极到Transwell中，长电极插入下腔，短电极在上腔，待电阻值稳定后记录数值，重复测定3次，取平均值。内皮细胞的电阻值为（实测电阻值－空白电阻值）×Transwell有效膜面积，单位为Ω·cm2。
1.4.5 免疫荧光检测ZO-1
取3~5代处理后的肺静脉内皮细胞，用4%多聚甲醛固定15 min，0.1% Triton破膜1 min，1%BSA封闭10 min，一抗4 ℃过夜，二抗常温避光孵育1 h，DAPI避光孵育10 min，每一步骤均要用PBS洗3次，每次5 min。激光共聚焦显微镜观察（激发波长：488 nm，发射波长：535 nm）ZO-1的表达。
1.4.6 线粒体的呼吸控制率测定
取大鼠的肾脏和小肠组织5 g，用PBS洗干净血渍，放入20 mL冰冷的分离缓冲液中（蔗糖0.25 mol/L，Na2EDTA 0.1 mmol/L，Tris 0.01 mol/L，pH=7.6）匀浆，将组织匀浆液在4 ℃以1 600×g离心12 min，将上清液在4 ℃以25 000×g离心15 min，收集沉淀并重悬于1 mL分离缓冲液中，并通过文献[10]中Lowry法测量线粒体蛋白浓度；将1.4 mL测量缓冲液（Tris 0.2 mol/L，pH 7.6，KCl 15 mmol/L，KH2PO4 15 mmol/L，Na2EDTA 1 mmol/L，MgCl2 5 mmol/L，蔗糖0.25 mol/L）加热至30 ℃，将反应混合物加入反应室中并平衡2 min，然后将0.2 mL 3 mg/mL线粒体混合物加入反应室中并平衡20 s，依次加入10 μL 0.5 mol/L苹果酸钠（C4H4Na2O5·H2O）和谷氨酸钠（C5H8NNaO4）和5 μL ADP（400 nmol/L）。通过线粒体溶氧仪（MT 200，Stranthkelvin，苏格兰）测定耗氧率。呼吸控制率（有和没有ADP的消耗氧气率）反映了线粒体功能。
1.4.7 肺静脉内皮细胞ROS测定
细胞密度长至90%时消化接种至共聚焦培养皿，待细胞长至适合密度，按照1:500加入DCFH-DA于无血清培养基中，置于37 ℃孵箱中孵育30 min，在共聚焦显微镜下观察荧光强度（波长488 nm），以荧光强度表示细胞中ROS含量。
1.5 统计学方法
采用SPSS 19.0统计软件，数据以x±s表示，两组均数比较用t检验，多组比较用单因素方差分析。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 SS-31对脓毒症大鼠肾脏、肺脏血管和肠通透性的影响
与假手术组比较，脓毒症大鼠的肾脏、肺脏血管和肠道通透性均显著增加（P < 0.01）；常规治疗可轻微降低肾脏、肺脏血管和肠道的通透性，但无统计学意义（P>0.05）；SS-31治疗可明显降低肾脏、肺脏血管和肠道的通透性，与常规治疗组比较，SS-31早期治疗组分别降低了31%、36%和56%，SS-31晚期治疗分别降低了12%、21%和48%，其中，SS-31早期治疗效果更好，与常规治疗组比较，有显著性差异（P < 0.01，图 1）。
图片

2.2 SS-31对内皮细胞屏障的保护作用
利用免疫荧光检测ZO-1的表达，观察细胞连接，结果显示，未经LPS刺激的内皮细胞间连接紧密，完整，且表达较多；LPS刺激12 h后，细胞间连接呈明显的断裂、碎片，且表达降低；而SS-31预处理后细胞形态恢复，细胞间连接紧密（图 2A）；ZO-1蛋白表达结果显示，LPS刺激后ZO-1蛋白表达降低(P < 0.01)，SS-31可以增加LPS所致的ZO-1的降低(P < 0.01，图 2C、D）；TER结果显示：与正常对照组比较，LPS刺激后，TER随着测定时间延长逐渐降低(P < 0.01)，而SS-31早期治疗可增加LPS刺激引起的TER降低(P < 0.01，图 2B）。
图片

2.3 SS-31对脓毒症大鼠肾脏和肠道线粒体功能的影响
脓毒症后大鼠的肾脏和肠道线粒体功能均显著降低（P < 0.01），表现为脓毒症组的肾脏和肠组织的线粒体呼吸控制率降低；CT治疗对肾脏和肠组织的线粒体功能改善不明显（P>0.05）；SS-31可明显恢复肾脏和肠的线粒体功能，不管是早期治疗还是晚期治疗，其作用显著好于CT治疗组。其中SS-31早期治疗效果最为明显，大鼠肾脏和肠道的线粒体功能分别恢复到正常水平的97%和92%（图 3）。
图片

2.4 SS-31对内皮细胞ROS的影响
正常内皮细胞中产生ROS较少，绿色荧光较弱；LPS刺激后内皮细胞荧光强度明显增强，SS-31可减弱LPS引起的荧光增强（图 4）。绿色荧光强弱反映了ROS产生的多少。
图片

3 讨论
脓毒症是感染引起的以全身炎症反应为特征的临床重症，可导致多器官功能障碍，血管渗漏是脓毒症的病理生理变化特征之一，严重影响着脓毒症的发生发展过程。尽管对血管渗漏研究较多，但尚未完全阐明其发生机制，尚缺乏有效的治疗措施，因此有效的治疗药物对脓毒症血管渗漏至关重要。
脓毒症时，重要器官线粒体功能障碍，而线粒体是细胞能量的加工厂，在机体能量生成、细胞内Ca2+调节、自由基产生、信号转导和细胞凋亡调节过程中发挥着重要的作用，同时线粒体也是产生活性氧的主要场所。线粒体功能障碍严重影响着疾病的发生发展过程，有研究表明，线粒体功能障碍时产生的ROS增加、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）生成减少严重影响着高血压的发生发展。
SS-31作为线粒体抗氧化剂，具有稳定性好、水溶性好以及半衰期较长等优点[11]，该药物能在细胞膜上自由扩散，既往研究显示SS-31很容易被细胞摄取[12-13]，如在神经母细胞瘤细胞中，30 min即可达到浓稳态度。分离的鼠肝、脑线粒体的研究表明，SS-31能被线粒很快摄取，不到2 min就能达到最大吸收率[12]；深入的研究表明，85%被摄入线粒体的SS-31主要结合在线粒体内膜上[14]。为了更好地观察SS-31对脓毒症大鼠血管通透性早期的保护作用，参考其他人的研究[15-16]，本研究采用预给药的方式，让细胞和线粒体充分摄取SS-31从而更好发挥作用。但研究也显示SS-31的摄取不依赖于线粒体膜电位，去极化的线粒体也能摄取SS-31，提示发挥功能异常的线粒体也能摄取SS-31，已有研究应用SS-31于疾病发生之后观察其疗效[15, 17]。因此，本研究也观察了SS-31对脓毒症大鼠血管通透性晚期的治疗作用。以往研究发现可减少脓毒症小鼠海马神经元凋亡与炎症反应，从而减轻脑损伤[18]；李国民等[19]研究发现SS-31可以改善脓毒症诱导的急性肺损伤时的肺功能；王月华等[20]发现SS-31能够抑制高糖诱导的小鼠肾小球系膜细胞凋亡。但SS-31对脓毒症大鼠血管通透性是否具有保护作用尚不明确。本研究结果显示：SS-31可降低脓毒症大鼠的肺、肾和肠血管通透性；同时在细胞水平上，SS-31可增加肺静脉内皮细胞间的连接和TER。提示SS-31对脓毒症大鼠的血管通透性有保护作用。那么，SS-31是通过什么分子机制发挥对脓毒症大鼠的保护作用呢？
目前关于SS-31研究较多的是作为一种抗氧化肽，作用在线粒体内膜上，通过抗氧化应激发挥其保护作用。如LI等[21]研究发现SS-31可通过抗氧化应激发挥对高糖诱导的糖尿病肾病的保护作用；LI等[22]研究发现SS-31对脓毒症引起的器官功能障碍有保护作用，其机制与抑制促炎细胞因子、氧化应激有关。为此本研究也验证了SS-31是否通过抑制线粒体氧化应激而发挥对脓毒症血管通透性的保护作用。结果显示脓毒症后活性氧含量明显增多，SS-31明显降低细胞内的活性氧含量，结果提示SS-31对脓毒症大鼠血管通透性的保护作用与抑制氧化应激有关。
综上所述，本研究显示SS-31对脓毒症大鼠的血管通透性有保护作用，其机制与抑制氧化应激有关，为临床脓毒症的治疗提供新的策略。
免责声明：本文为行业交流学习，版权归原作者所有，如有侵权，可删除。

回复此楼