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[交流]
蛋白提取纯化常见问题？
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1、蛋白纯化标签应该如何选择？ 在进行蛋白表达时，选择合适的标签有利于蛋白的纯化，促进蛋白的可溶性，因此了解几种常用的蛋白纯化标签很重要。 一般来说，常用的蛋白纯化标签主要有His tag、GST tag、MBP tag、NusA tag、Strep tag，那么这些蛋白纯化标签有什么不同之处呢？ His tag（组氨酸标签）融合蛋白是目前最常见的表达方式，其优点是标签小，纯化步骤简便，纯化条件温和，能纯化可溶性/包涵体蛋白，一般不会影响蛋白的功能结构，且可以产出大量的目标蛋白，但该标签不适合易氧化蛋白或膜蛋白的纯化。 GST tag（谷胱甘肽巯基转移酶）的洗脱条件温和，有助于保持蛋白功能活性，适合pull-down 检测，具有很好的线性动态范围，但分子量较大，可能会影响蛋白质的功能和下游实验，如果蛋白不可溶，很难用变性的方法进行纯化。 MBP tag（麦芽糖结合蛋白标签）可以减少目标蛋白的降解，增加蛋白的表达量和稳定性，提高表达产物的水溶性，但标签较大，对蛋白的结构和功能会有一定影响。 NusA tag（转录终止/抗终止蛋白标签）不具有独立的纯化标签功能，需要和其他标签（如His标签）联用，可提高蛋白质的溶解性，但由于分子量较大，对蛋白下游应用会有影响。 Strep tag（strep标签）能产出高纯度（95%）的目标蛋白，且能保持目标蛋白活性，主要是因其纯化流程温和。其次，能进行变性条件下的纯化。在用于WB/ELISA，可侦测目标蛋白。另外，还可固定目标蛋白，检测蛋白质交互作用，或更进一步用以筛选治疗用蛋白质，或是工业用酵素。但Strep tag纯化系统的价格相对His tag而言较高，所产出的目标蛋白数相对较少。 2.利用疏水性质，用反向 HPLC 方法分离的原理？ 反相和疏水都是依据物质的极性来纯化的，极性越强先出来，极性越弱越后出，洗脱疏水是高盐吸附低盐洗脱，反像是极性强的流动相吸附，降低它的极性洗脱，选择主要是依据填料的特点以及样品本身的特点而改变的。 疏水的填料疏水集团密度只是反相的 10%左右,其他的都是亲水的,而反相正好相反,它的表面全是疏水基团,因此疏水一般需要高盐吸附,低盐洗脱,反相一般用甲醇水乙睛水吸附,洗脱是逐渐增加有机溶剂的量.由于以上的原因,疏水比反相要温和,蛋白一般不变性,由于填料多为琼脂糖凝胶,所以蛋白回收率高,而反相适合做分析多,也有做制备的,那也是一些分子量相对小的多肽,反相的回收率也低, 因为硅胶杂吸附的原因.疏水色谱是纯化蛋白的另一个有力的工具。 3.重组蛋白A琼脂糖凝胶 FF 能一次纯化大量血清 IgG 吗？如几十毫升,如用环氧活化的琼脂糖凝胶纯化血清 IgG，先要偶联其相应配基如抗体或蛋白 A 是吗？这里琼脂糖凝胶用环氧活化的意义是什么？ 几十毫升如果一次纯化也就用几十毫升的 重组蛋白 A 琼脂糖凝胶 FF 就可以,也可以分两三次纯化,这都没有问题,如果是你想做血清中的抗体纯化也可以把抗原偶联到环氧活化琼脂糖凝胶上, 这样得到的抗体更纯, 一般不选择蛋白 A, 环氧活化便宜,而且相成的键很稳定,没有非特异吸附,是个不错的方法。 4. 通过 His 标签纯化的蛋白，杂带比较多，如何改进？ （1）如果纯化的是上清，蛋白酶会部分降解目的蛋白，可通过加多种蛋白酶抑制剂改进。 （2）可提高杂蛋白与镍柱结合起始咪唑浓度，以降低杂蛋白与镍柱的亲和力。 （3）杂蛋白和目的蛋白结合，可通过超声前加入去垢剂的方式消除（1%-2%Tritonx-100）。 5. 镍柱使用中出现棕色是怎么回事? 出现这样的情况，主要是缓冲液中 DTT 的影响，DTT 会对镍柱的颜色和纯化效率有很大的影响，在碱性的缓冲液条件下镍离子会被 DTT 还原生成棕色的沉淀，所以所有镍柱的生产商都强调要尽量避免 DTT 的参与（一般的镍柱耐受小于 5mM DTT，推荐缓冲液中不要超 2mM DTT）。 6. 镍柱堵了怎么办？ （1）柱子发生堵塞，可能是样品中细胞碎片或其他杂颗粒所致，所以样品一定要高速离心，并过0.22或者0.45的膜。 （2）上清纯化时，蛋白发生变性，有絮状物产生，赶紧加入 1-2mM DTT （上清样品处理要在冰浴中进行），还不行加尿素变性，使其在变形环境下。 （3）样品处理时的料液比不要太小，否则黏度大，或者导致蛋白析出或变性，料液比要在 1/10-1/15 之间较适宜。 7. 纯化过程中，蛋白出现了浑浊，怎么办？ （1）出现浑浊，说明蛋白处在不稳定的环境中或者自身就不稳定，所以要检查缓冲体系是否正确，环境是否低温，或在缓冲液中加入还原剂 DTT。 （2）加入肌氨酸钠，迅速使蛋白变性，消除浑浊现象。 8. 没能纯化到带 His 标签的蛋白，蛋白都流穿了（未挂柱）？ （1）超声的功率不对（太大，蛋白炭化，太小，蛋白没有释放） 策略：改变超声功率，并在超声前加入溶菌酶。 （2）样品或者是结合缓冲液不正确 ；策略：检测 pH 及样品和结合缓冲液的组成份。 （3）组氨酸的标签没有完全的暴露 ；策略：在变性条件下（用 8M 脲，6M 盐酸胍，1%SDS） 并加入 1-2mMDTT 进行纯化。 （4）His 标签丢失；策略 1：WB 或者 anti-his 的抗体检查 His 是否表达，上游构建，改变 his-tag 的位（C-terminal orN-terminal），必要时增加 his 个数（常用 6-10 个）；策略 2：孵育的时间不够，降低流速和增加孵育的时间；策略 3：改变螯合的金属离子，寻找到最佳的结合金属离子。 Ni2+通常是从宿主细胞蛋白中纯化大多数（组氨酸）6 标记的重组蛋白质的首选金属离子，也是一般最常用的离子。 蛋白和金属离子之间的结合强度受几种因素影响，包括长度、位置、亲和标记在蛋白的暴露程度、所用离子的类型、以及缓冲液的 pH，因此一些蛋白用其他离子可能更容易地进行纯化而不用 Ni2+。可以利用 Hitrap IMACHP 来筛选不同的金属离子。 9. 蛋白挂在柱子上洗脱不下来，怎么解决？ （1）洗脱条件太温和（组氨酸标记的蛋白质仍然结合在柱上，结合力较强） 策略：用增加咪唑的梯度洗脱或降低pH 来找出最佳的洗脱条件。 （2）降低 PH 的方法洗脱的，因为若 PH 低于 3.5，会导致镍离子脱落策略：改变洗脱办法，咪唑竞争性洗脱。 （3）蛋白已沉淀在柱上策略：减少上样量和孵育的时间，试用去污剂（1%-2%Tritonx-100）或改变 NaCl 的浓度，或在变性条件下洗脱（用 8M 脲，或 6M 盐酸胍），最终也可在洗脱 Buffer 中加入 2mMDTT 或者 0.5%肌氨酸钠进行洗脱。 （4）非特异性疏水或其他相互反应策略：加非离子去污剂到洗脱缓冲液（如，2%Triton X-100）或增加 NaCl 的浓度。 10. 如何处理样品，可使其初步提纯（如何洗去蛋白的自身带）？ （1）上清样品处理，要加入去污剂，蛋白酶抑制剂，还原剂，还要注意温度及超声破碎的参数。 （2）去大肠杆菌自身带（两条 30KD-40KD）可用非变性缓冲液超声悬浮（加入去垢剂），离心 6000r/min，30min，10℃。（若效果不够可继续上述步骤）。 （3）大肠杆菌包涵体的洗涤，可用包涵体洗液多洗几遍，也可用 1M/2M/4M/8M 尿素逐步溶解，可选取其中纯度最佳的。 （4）可用硫酸铵沉淀法，初步提纯。 |
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