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aniulin

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[交流] 【分享】关于TLC应用的一些知识

　　薄层色谱(TLC)是一种微量分离分析技术,具有样品用量少、分离效果好、快速、简便等特点,是实验室常规分析手段,常用于以下方面:为柱色谱选择合适的展开剂,监视柱色谱分离状况和效果;检测反应过程,反应副产品产物的检查,中间体分析;中草药、药材及其制剂真伪的检查、质量控制和资源调查;化学药品及制剂杂质的检查;临床和生化检验以及毒物分析等。

1　基本操作
在进行薄层层析时,首先要熟练掌握其基本操作要求。
1. 1　铺板
铺板用的匀浆不宜过稠或过稀。过稠,板容易出现拖动或停顿造成的层纹;过稀则水蒸发后,板表面较粗糙。匀浆配比一般是硅胶G∶水= 1∶2～3,硅胶G∶羧甲基纤维素钠水溶液= 1∶2。研磨匀浆的时间,根据经验来定,与空气湿度有关,一般通过拿起研棒时匀浆下滴的情况来判断,越稠越难下滴。匀浆的稀稠除影响板的平滑外,也影响板涂层的厚度,进一步影响上样量。涂层薄,点样易过载;涂层厚,显色不易明显。通常,板的质量对薄层鉴别的影响不是很大,影响最大的是展开剂的配制和展开系统的饱和。
1. 2　点样
尽量用小的点样管以使斑点较小,展开的色谱图分离度好,颜色分明。样品溶液的含水量越小越好,样品溶液含水量大,点样斑点扩散大。在点状点样时,样品溶液易形成“环状色谱”,导致样品在点样原点上的不均匀分布。在展开后,斑点可能展宽或不均匀。当样品溶解于对其溶解性很强的溶剂中时,这种现象更为严重。点样量较大时可采用条形,样品条带状点样,便于色谱的目视。如果这些条带是通过喷雾产生的,在整个条带上的样品的均一性又可得到进一步的提高。这是得到可靠的和可重复的定性分析结果的基础。
1. 3　展开剂配制
选择合适的量器把各组成溶剂移入分液漏斗,强烈振摇使混合液充分混匀,放置,如果分层,取用所需的液层作为展开剂。不应把各组成溶液倒入展开缸,振摇展开缸来配制。混合不均匀和没有分液的展开剂,会造成层析的完全失败。各组成溶剂的比例准确度对展开剂不同的分析任务有不同的要求,尽量达到实验室仪器的最高精确度,比如:取1ml的溶剂,应使用1 ml的单标移液管,移液管应符合计量认证要求,尽管多数时候这不是必须的。
1. 4　展开系统的饱和
一般使用的是双槽的展开缸,一槽用来放展开剂,另一槽可加入氨水或硫酸。把待展开的板放入,使展开剂的蒸气充满展开缸,并使薄层板吸附蒸气达到饱和,防止边缘效应,饱和时间在15 min左右。
1. 5　温湿度的控制
温湿度对薄层影响都很大。不冻结的前提下,通常温度越低分离越好,较难的分离需在低温下分离,例如人参皂苷。湿度的影响,估计主要是影响薄层板的吸附能力,导致选择性(容量因子)的变化,湿度应根据实际情况确定。温度控制使用空调器或冰柜,湿度控制是通过在另一展开槽放置相应浓度的硫酸。
1. 6　显色
喷显色剂显色最重要是有好的雾化器,喷雾均匀,液滴细微。
2　异常斑点的出现及相应解决方法
在薄层色谱过程中,色谱条件的确定、色谱结果的判断是非常重要的,色谱斑点的好坏是判断色谱结果的关键。尽管按上述基本要求操作,但有时还会出现斑点异常现象,如拖尾、边缘效应、S形和波形斑点、念珠状斑点、斑点Rf相差悬殊、斑点Rf值不稳定等,严重干扰色谱结果的判断,影响样品鉴别的准确性及可靠性。对此,必须找出异常斑点的产生原因及克服方法。
2. 1　拖尾现象　会使斑点间界限模糊,分离不好。产生这种现象常与点样量、展开剂的pH值、吸附剂的pH值等因素有关。点样过量会导致超载拖尾,克服办法是选择合适的点样量;展开剂的pH值,会影响样液中酸、碱性成分在其中的解离形式,不同形式的物质极性不同,在薄层板上移动的速度就不同,即会产生拖尾。克服办法是根据化合物的性质,选择不同pH值的展开剂,使化合物成为一种形式存在而被展开。少量酸、碱的加入可使某些极性物质的斑点集中。吸附剂pH值的影响亦如此,可在层析分离酸性化合物时选用硅胶为吸附剂,层析分离碱性化合物时选用碱性氧化铝为吸附剂。
2. 2　边缘效应　产生的原因主要是用混合溶剂展开时,极性较弱和沸点较低的展开剂在薄层板两边沿处较易挥发,致使在薄层板两边沿的浓度比在中间的低,板上展开剂的比例不一致,极性发生变化,展析结果即产生边缘效应。常用的克服办法有:增加层析缸中溶剂蒸气饱和度;选用较合适的单一展开剂代替混合展开剂;采用共沸展开剂代替一般混合展开剂。
2. 3　S形及波浪形斑点的形成,主要是由于薄层板厚薄不均而影响展开速度所致,其克服办法是制备平整的薄层板。
2. 4　念珠状斑点是化合物的斑点之间距离小,互相连接起,形如一串佛珠。引起念珠状斑点的原因较多,主要有以下几种:
2. 4. 1　络合物的形成,如氨基酸的层析,由于吸附剂中所含有的微量铜离子与氨基酸形成的络合物,这样一种化合物在薄层层析中出现2个Rf值相近的斑点,呈念珠状。对于这种念珠状斑点的克服,采用加掩蔽剂的办法[ 2 ] 。
2. 4. 2　层析样品中成分过多,以致在一定长度的薄层上排布不开,彼此重叠,形成念珠状斑点。克服的办法是进行双向层析,使斑点分布面积增大,或适当增加展层长度,使斑点间距离加大,或用不同极性有机溶剂萃取样品液,使之分成几个不同极性的检样,然后分别进行层析。
2. 4. 3　在原点处点样时形成复斑,当展开后,各斑即成为念珠状斑点。克服办法是控制样品溶液在一定的浓度,点样1～3次完成,同时2次点样中心要重合。
2. 5　展层后斑点Rf值相差悬殊,如中药材的薄层色谱,主要是由于中药材中常含有数种极性相差较大的化合物,当用一种展开剂展开后,一部分斑点被展开到展开剂前沿附近,另一部分则留在原点附近,分离效果不好[ 3 ] 。克服办法是二次展开。第1次先用极性较大的展开剂,把样品中极性相差较大的2类成分展开一定距离,使极性较大的几种成分的斑点能较好地分开。然后取出薄板,挥干展开剂,更换另一种极性较弱的展开剂,进行第2次展开,使溶剂前沿达到薄层板前端,这样极性较弱的成分也得到分开。
2. 6　层析斑点Rf值不稳定,这是中药材薄层色谱时常遇到的问题。有时即使完全按文献条件进行层析,其斑点的Rf值也很难与文献上相符。这种现象主要是通过控制层析温度稳定( ±0. 5 ℃) 、薄层厚度(0. 2～0. 3 mm)以及吸附剂、展开剂的质量(尽可能选择同厂、同批号的产品)来加以克服。

[ Last edited by jw227 on 2009-10-10 at 10:21 ]

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1楼 2009-10-09 20:33:51

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