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巨噬细胞的提取和分离方法
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· 检测步骤 · 01、材料 昆明小鼠，SPF级，体质量18～22 g，雄性，6～8周龄。 02、肉汤制备 6%淀粉肉汤制备 将1.0g胰蛋白胨、0.3g牛肉浸膏和0.5g氯化钠放入盛有100 mL双蒸水的烧杯中，置于磁力搅拌器常温溶解后121℃灭菌30min，于4℃保存。 3%巯基乙酸盐肉汤的制备 1L双蒸水中加入29g巯基乙酸盐，煮沸使其完全溶解，玻璃瓶或离心管分装后121℃灭菌15min，4℃保存，使用前确保已经冷却。 03、巨噬细胞的诱导 每次腹腔注射3%巯基乙酸盐肉汤1mL，每天1次，3d后用预冷PBS灌洗腹腔2次。 04、巨噬细胞的收集 准备75%乙醇，以脱颈方式处死小鼠，浸泡3min。取出，置于无菌操作台，仰卧位固定小鼠，右手持注射器于右下腹部将针头刺入皮下进入腹腔，将5mL预冷的PBS(培养液组为5mL预冷的10%血清ＲPMI 1640培养液) 注入腹腔，按摩小鼠腹部5min。无菌条件下剪开小鼠腹部皮肤显露胸腹部，用无菌止血钳提起剑突处组织，无菌剪刀在该处剪开约1mm2小口。注意止血钳保持提起状态，用无菌巴氏吸管从腹腔开口深入腹腔，反复冲洗腹膜腔灌洗液2次，可回收约8mL 淡黄色灌洗液。 05、巨噬细胞的纯化与培养 将每只小鼠的灌洗液于常温条件下1000r /min 离心10min，所得细胞沉淀用ＲPMI 1640培养液重悬接种，培养体系于37℃静置培养2～3h后洗去未贴壁细胞，余下的贴壁细胞即为巨噬细胞。 06、巨噬细胞形态学观察及计数 细胞贴壁培养24h后在倒置显微镜下观察各组细胞形态。用0.5%胰酶消化细胞，离心弃上清液，PBS重悬得到细胞悬液，用细胞计数板计数每只小鼠腹腔中分离的巨噬细胞数量。 07、台盼蓝染色检测巨噬细胞活性 将500μL“1.6中”的各组巨噬细胞悬液和500μL台盼蓝染液(0.4%浓度) 加入3.5cm培养皿，摇匀后静置3～8min; 吸取1滴混合液滴入载玻片，3min内镜下计数巨噬细胞200个，分别统计活/死细胞数目(死细胞呈蓝色，活细胞无色透亮) ; 细胞活性(%) = 活细胞数/200×100%。每组检测重复3次。 |
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